Люминесценция и фотохимические процессы в системах, содержащих тиминовые хромофоры

2
ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.................................................
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
A. КОМПОНЕНТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ: ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА. НОМЕНКЛАТУРА, ТАУТОМЕРЫ, ИОННЫЕ ФОРМЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ВОДОЙ, АГРЕГАЦИЯ, КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ.................................7
I. Основания, нуклеозиды, нуклеотиды, ди- и полинуклеотиды, РНК и ДНК: химическая структура и номенклатура.................................................................................. 7
II. Таутомерные и ионные формы азотистых оснований нуклеиновых кислот и их производных. Взаимодействие с компонентов нуклеиновых кислот с вЫюй. Стэкинг-взаимодействия.....................10
1. Таутомерные и ионные формы азотистых оснований.............................................10
2. Взаимодействие с водным окружением, водородные связи и взаимодействия азотистых оснований нуклеиновых кислот в водных растворах ....................................................................13
III. Кристаллические формы оснований нуклеиновых кислот, нуклеозидов и нуклеотидов. Кристаллы пт-мина - безводные и кристаллогидрат...........................................................15
1. Разнообразие возможных типов кристаллических форм компонентов нуклеиновых кислот...........15
2. Кристаллические формы тимина .............................................................16
Резюме..........................................................................................18
Б. СПЕКТРЫ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ПОГЛОЩЕНИЯ И ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ КОМПОНЕНТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.
Проявления взаимодействий между хромофорами........................................................19
I. Спектры поглощения, люминесценции и ее возбуждения компонентов нуклеиновых кислот при 77К..20
II. Спектры поглощения, люминесценции и ее возбуждения компонентов нуклеиновых кислот при комнатной температуре..............................................................................21
Резюме..........................................................................................30
B. ФОТОХИМИЯ ПИРИМИДИНОВЫХ КОМПОНЕНТОВ нуклеиновых кислот..........................................31
I. Цикяобутановая фотодимеризация пиримидиновых компонентов нуклеи новых кислот..................31
I. Структура циклобутаноиых фотодимеров пиримидиновых компонентов нуклеиновых кислот..........35
2 Образование циклобутановых фотодимеров пиримидиновых компонентов нуклеиновых кислот при низкой температуре во льду........................................................................ 37
3. Образование циклобутановых фотоднмеров при ультрафиолетовом облучении тимина при комнатной температуре в твердом состоянии................................................................ 38
4. Образование циклобутановых фотодимеров при ультрафиолетовом облучении жидких растворов пиримидинов40
4.1. Образование под действием ультрафиолетового облучения циклобутановых фотоднмеров в водных растворах тимина и его производных.................................................................. 41
4.2. Циклобутановая фотодимеризация других пиримидиновых оснований в водных расгворах ......42
4.3. Циклобутановая фотодих1сризяция в водных растворах ди- и полинуклеотидов, ДНК и РНК....42
5. 1 [иклобутановая фотодимеризация в фиксированных парах, полученных фотолизом циклобутановых димеров пиримидином в этнленгликоле с водой при 80К.................................................. 43
II. Фотогидратация пиримидиновых компонентов нуклеиновых кислот..................................46
III. Дезаминирование ц и тот на и его производных................................................46
IV. Фотоаддукты..................................................................................48
V. Вторичные фотохимическиереаклпш- образование фототримеров и фототетрамеров....................50
VI. Фотохимические свойства пиримидиновых компонентов нуклеиновых кислот и биологические системы...........................................................................................53
1. Спектр действия ультрафиолетового света на биологические системы и спектр поглощения нуклеиновых кислот, сенсибилизация........................................... ...................................54
2. Фоторспарация и темновая репарация.........................................................55
Резюме..........................................................................................56
Г. О ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ОБРАТИМОЙ ФОТОДИМЕРИЗАЦИИ ПИРИМИДИНОВ ДЛЯ ЗАПИСИ ИНФОРМАЦИИ ...............................................................................................58
ЧАСТЬ ВТОРАЯ. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧ ............................................................... 61
ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ. МЕТОДЫ -------------------------------------------------------------------- _------62
А. Использованные препараты........................................................................62
I. Нуклеиновые основания и полинуклеотиды........................................................62
II. Растворители.................................................................................62
Б. ОБОРУДОВАНИЕ....................................................................................63
1. Спектрофлуориметр ".Hitachi 850"..............................................................63
/. Оборудование, применявшееся для облучения об]юзцов при исследовании их (фотохимии.............66
III. Измерение интенсивностей облучающего света..................................................68
3
в. Методы работы.............................................................................68
/. Методы работы с жидкими растворами при комнатной температуре............................68
II. Методы работы с кристаллами и твердыми плёнками на кварцевой подложке при комнатной температуре.....................................................................................69
1 Получение кристаллогидрата и безводного тимкна ...................................... 69
2. Исследование люминесценции кристаллов ................................................69
3. Исследование спектров поглощения, люминесценции и ее возбуждения твердых слоев на кварцевых подложках ........................................................................................ 69
Г. МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ...................................................................70
ЧАСТЬ ЧЕТВЁРТАЯ. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................. „..71
А Люминесценция и фотохимия тимина в водных растворах при комнатной температуре..............71
/. Спектры поглощения, люминесценции и её возбуждения водных растворю тимина при комнатной
температуре, и их изменения в процессе исследования........................................72
II. Фотофизические и фотохимические причины изменения спектров люминесценции и её возбуждения
водных растворов тимина в процессе их исследования.........................................74
Основные результаты........................................................................76
Б. Люминесценция и фотохимия тимина в твердом состоянии на кварцевых подложках при
КОМНАТНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ........................................................................78
Введение...................................................................................78
I. Ультрафиолетовые спектры поглощения, люминесценции и ее возбуждения кристаллов и слоев тимина
81
П. Цикл обута новая фотодимери зация птмина в твёрдых сюях на кварце: квантовые выходы.....84
Ш. Образование ({ютоаддуктов...............................................................88
IV. Квантовые выходы фототримери зации тимина в твёрдых слоях..............................88
Основные результаты........................................................................91
В. Люминесце.1 тция и фотохимия политимидиловой кислоты в водных растворах при комнатной температуре...............................................................................94
I. Спектры поглощения водных [мство/хю полштшидияовой кислоты при комнатной температур 98
II. Динамика циклобутановой фотодимери зации политимидилсвой кислоты.......................99
1. Проявления гетерсиенмостм водных растворов политимидилсвой кислоты в изменении формы их спектров поглощения под дейстиием УФ облучения.....................................................100
2. Неоднократная обратимость циклобутановой фотодимеризации в водных растворах пегтитамидиловой кислоты 106
III. Спектрально-люминесцентные проявления гетерогенности водных растворов полипшмидюкзвой кислоты .................................................................................109
IV. Об/хгзование побочных фотопродуктов н водных/шетворах политимидиловой кислоты.........114
V. Квантовые выходы фототргшеризацип в водных растворах политимидиловой кислоты...........120
Основные результаты.......................................................................121
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ .............................................................. 124
ЗАКЛЮЧЕПИЕ ...............„...................... „„......„........................„....„...„126
ЛИТЕРАТУРА....................................................................................127
ПРИЛОЖЕНИЯ 140
Приложение А. Обоснование метода определения ква1гговых выходов фоюдимеризацин тимина в
оптически ТОНКИХ СЛОЯХ по падению его люминесценции под действием ОБЛУЧЕНИЯ.................140
Приложение Б Оыхнование метода определения квантовых выходов фотогримеризацци тимина по СК01ЮСТИ ПАДЕНИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ФОТОАДДУКТА ПОД ДЕЙСТВИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ 142
4
Введение
Интерес к исследованию фотофизических и фотохимических явлений в тимине возник в связи с тем, что обратимая фотодимеризация тимина является одной из основных фотобиологи ческих реакций [Fiser, G.J., and Н.Е. Johns, 1976(a); Wang, S.Y., 1976 (а)]. Известно, что к фотомутагенезу, фотоканцерогенезу и гибели клеток под действием ультрафиолетового (УФ) облучения ведут в первую очередь фотохимические процессы в тиминовых компонентах дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (Альберте, Б., Д. Брей, Дж. Льюис, и др., 1986].
Причина, побуждившая пас к изучению фотопроцсссов в системах, содержащих ти-миновые хромофоры - принципиальная возможность их технического использования. Обратимая реакция циклобутановой фотодимеризации пиримидиновых оснований, в принципе, приг одна для фотохимической записи информации (Рапопорт, В.Л., 1991; Yano, Ei, and S.Tatsuura, 1991 j, и этим определяется актуальность работы. Наиболее перспективными для этой цели могут считаться производные тимина, так как для них не свойственны возможные параллельные реакции фотогидратации и дезаминирования, характерные для урацила и цитозина. Кроме того, именно для производных гимина (димстилтимииа) наблюдался предельный квантовый выход фотодимеризации, равный 1,0, который исключает возможность параллельного протекания любых фотореакций, в том числе необратимого образования фото-аддугсгов, что часто сопровождает фотолимеризацию. Такой квантовый выход наблюдался в фиксированных парах молекул диметилтимина, полученных фотолизом цнклобутановых димеров R стеклующейся смеси этиленгликоля с водой (ЭПЬЬО) при 80К, для которых характерно межпло-скостное расстояние 2,9 А, что проявляется в экситонном расщеплении их спектров погло-щения -4000 см'1 [Eisingcr, J., and А.А. Lamola, 1967, 1969; Lamola,
A.A.,1966; Lamola, A.A., and J. Eisingcr, 1968J. Необычно малое межплоскостнос расстояние было интерпретированно как следствие плотной упаковки (Рапопорт, B.JL, 1993].
Целью представляемой работы было исследование методами абсорбционной и люминесцентной спектроскопии межмолекулярных взаимодействий в системах, содержащих ти-миновые хромофоры (при ТКомн), и поиск плотноуггакованных стопочных агрегатов тимина с экситонным расщеплением cricicrpOB поглощения ~4000 см 1 в связи с перспективностью их использования для обратимой фотохимической записи информации. Для этого было необходимо изучение циклобутановой фотодимеризации тимина, проверка её многократной вое-
5
производя мости и вклада в фотохимию систем с тимииовыми хромофорами побочных по отношению к ней реакций, в случае их обнаружения.
В работе исследовались спектры УФ поглощения, люминесценции и её возбуждения для исходных состояний содержащих тиминовые хромофоры систем (водные растворы ти-мина; два типа кристаллов тимина - безводный и кристаллогидрат, и полученные из них слои; водные растворы политимидиловой кислоты (ро1у-Т)), а также кинетика их изменения в результате фотопроцессов, вызываемых УФ облучением. По кинетике спада люминесценции твёрдых слоев тимина под действием УФ облучения определялись квантовые выходы фотодимеризации. Регистрация спектров люминесценции, сё возбуждения, а также - поглощения (по однолучевой схеме) проводились с использованием спсктрофлуориметра ''Хитачи-850" (с автоматической коррекцией спектров).
В результате проведённых исследований удалось получить ряд новых результатов:
1) Впервые показано, что противоречия в литературных данных по спектрам люминесценции и её возбуждения водных растворов тимина при комнатной температуре связаны с накоплением в образцах при люминесцентных измерениях фотопродукгов с относительно высокими квантовыми выходами люминесценции (фотоаддуктов).
2) Впервые проведено исследование спектров люминесценции двух типов крис таллов тимина (безводного и кристаллогидрата), а также спектров поглощения, люминесценции и её возбуждения полученных из них слоев на кварце. Для слоев кристаллогидрата обнаружены фракции с экситонным расщеплением спектров поглощения -4000 см'1 и относительно высокой фотохимической активностью. Для двух типов слоев впервые определены квантовые выходы фотодимеризации тимина.
3) Подробно исследованы спектры люминесценции и впервые исследованы спектры её возбуждения водных растворов политимидиловой кислоты при комнатной температуре. Выявлены две не описанные ранее полосы люминесценции, отнесённые к невзаимодействующим хромофорам и большим агрегатам. Впервые получены поэтапные разностные спектры поглощения водных растворов политимидиловой кислоты в процессе их УФ облучения и показано, что их фотохимическая активность в значительной мере обязана двум типам стопочных димеров с плотной упаковкой и экситонным расщеплением спектров поглощения -4000 см’1.
4) Впервые исследована многократная воспроизводимость обратимой фотодимеризации в водных растворах политимидиловой кислоты при комнатной температуре с целью оценки её применимости для записи информации и показано, что неполнота обратимости
6
фотодимсризации обязана побочным фотохимическим реакциям: образованию фотоаддук-тов и фототримеров.
Возвращаясь к ранее высказанному тезису о принципиальной возможности использования обратимой циклобутановой димеризации для записи информации, на основании полученных данных можно сделать выводы о практической осуществимости этой идеи. Как показывают литературные и полученные нами данные, обратимость циклобутановой димеризации, а соответственно - ее применимость для записи информации, ограничивается параллельным ей накоплением фотоаддуктов. Поиск путей с одной стороны - повышения квантовых выходов циклобутановой фотодимеризации, а с другой стороны - ингибирования побочной по отношению к ней фотохимии, должен стать целью дальнейших исследований.
7
Часть первая. Обзор литературы
А. Компоненты нуклеиновых кислот: химическая структура, номенклатура, таутомеры, ионные формы, взаимодействие с водой, агрегация, кристаллические формы
1. Основания, нуклеозиды, нуклеотиды, ди- и полинуклеотиды, РНК и ДНК: химическая структура и номенклатура
В этой главе приводятся только необходимые для понимания представляемой работы данные по химической структуре нуклеиновых кислот и их компонентов. Подробное освещение связанных с этим вопросов можно найти в [Альберте, Б., Д.Брей, Дж. Лыоис, и др., 1986; Бородавкин, А.В, Э.И.Будовский, Ю.В.Морозов, и др., 1977; Зенгер, В., 1987].
Азотистые основания нуклеиновых кислот являются производными двух гетероциклических соединений: пиримидина (т. н. пиримидиновые основания или "пиримидины") (рис. 1, а) и пурина (пуриновые основания, "пурины") (рис. 1, б). Собственно название "основания нуклеиновых кислот" связанно с их способностью присоединять ион водорода [Бородавкин, А.В, Э.И.Будовский, Ю.В Морозов, и др., 1977; Кочетков, Н.К., Э.И. Будовский, Е.Д.Свердлов и др., 1970]. Структуры входящих в состав РНК и ДНК оснований (за исключением минорных, см. [Альберте,Б., Д.Брей, Дж.Льюис, и др., 1986; Бородавкин, А.В, Э.И.Будовский, Ю.В.Морозов, и др., 1977; Зенгер, В., 1987], также приведены на рисунке 1 (в, г, д, е, ё). Принятая ну мерация атомов в гетероциклических кольцах оснований нуклеиновых кислот та же, что и в пиримидине и пурине (рис. 1, а, б) [Зенгер, В., 1987; Альберте, Б., Д.Брей, Дж.Льюис, и др., 1986; Бородавкин, А.В, Э.И.Будовский, Ю.В.Морозов, и др., 1977; ТяЮ, Р.О.Р., 1970].
Азотистые основания (см. выше) способны к образованию Ы-гликозидной связи с пятиуглеродным сахаром, рибозой (рис. 2, а) либо дезоксирибозой (рис. 2, б). Образование связи как правило происходит между 1-м атомом пентозы и 1-м атомом пиримидинового (рис.
2, в) либо 9-м атомом пуринового (рис. 2, г) кольца, получающиеся так соединения называются нуклеозидами (точнее, рибо- либо дезоксирибонуклеозидами) [Альберте, Б., Д.Брей, Дж.Льюис, и др., 1986; Бородавкин, А.В, Э.И.Будовский, Ю.В.Морозов, и др., 1977; Тэ'О, Р.О.Р., 1970; Зенгер, В., 1987].
8
а)
б)
в)
Д) е)
Ц N«2
є) ж)
N4-:
СООН
<"1^; 0&
N " " NN2
Рис.1. Структура пиримидиновых и пуриновых производных (нумерация атомов гетероциклов в пиримидиновых и пуриновых производных та же, что приведена для пиримидина и пурина):
(а) пиримидин; (б) пурин; (в) тимин; (г) урацил; (д) цитозин; (с) оротовая кислота; (а) аденин; (ж) гуанин. По [Альберте, Б., Д. Брей, Дж. Льюис, и др., 1986].
а)
носн2 ОН
ЇРИ
он он
д)
б)
О-—р— о —
І
о
Рис. 2. Пентозы, нуклеозиды и нуклеотиды:
(а) рибоза; (б) дезоксирибоза; (в) тимидин; (г) аденозин; (д) тимидинмонофосфат (Т.МР). По [Альберте, Б., Д. Брей, Дж. Льюис, и др., 1986].
10
Пентозы, входящие в состав нуклеозидов, способны вступать в реакции с фосфатами, обычно связывающимися с гидроксильной группой при их С-5' атоме, образуя нуклеотид (нуклеозидмонофосфат) (рис. 2, д), причём возможно присоединение более чем одной фосфатной группы [Альберте, Б., Д.Брей, Дж. Льюис, и др., 1986; Бородавкин, А.В,
Э.И.Будовский, Ю.В.Морозов, и др., 1977; Зснгер, В., 1987].
Нуклеозиды и нуклеотиды могут соединятся между собой простой фосфодиэфирной связью между 3' и 5' атомами их пентоз, образуя динуклеозиды (рис. 3, а), дшгуклсотиды (рис. 3, б), олигонуклеотиды (длинной около 10 мономеров) и полинуклеотиды (длинной более 100 мономеров) (рис. 3, в). В природе распространено два типа полинуклеотидов: РНК (из рибонуклеотидов) и ДНК (из дсзоксирибонуклеогидов). Тиминовыс компоненты входят в состав ДНК, в РНК тимин заменяется урацилом [Альберте, Б., Д.Брей, Дж.Льюис, и др., 1986J.
II. Таутомерные и ионные формы азотистых оснований нуклеиновых кислот и их производных. Взаимодействие с компонентов нуклеиновых кислот с водой. Стэкинг-взаимодействия.
1. Таутомерные и ионные формы азотистых оснований
Многие азотистые основания могут принимать различные таутомерные формы. Например, для аденина характерна N7-N9 прототропная таутомерия [Белякова, В.М., и В.Л. Рапопорт, 1988], для гуанина и цитозина - амино-иминная, для урацила - кето-енольная [Бородавкин, A.B., Э.И.Будовский, Ю.В.Морозов, и др., 1977; Kwiatkowski, J.S, and В. Pullman, 1975]. Теоретически, для тимина также возможна кего-енольная таутомерия (рис. 4), однако методами абсорбционной спектроскопии она не обнаруживалась, причём квантовомеханические вычисления также показывают низкую вероятность его перехода из кето-формы в енолъную [Бородавкин, A.B., Э.И.Будовский, Ю.В.Морозов, и др., 1977; Kwiatkowski, J.S, and В. Pullman, 1975].Однако, в ряде работ, посвящённых изучению люминесценции водных растворов тимина при делались попытки объяснить наблюдавшиеся спектральные явления именно присутствием редких, хорошо люминесцирующих, таутоме-ров (подробности ниже, в параграфе Б. 1.2).
11
0 о
1 Д. /СНв
н- а
б)
N
Л,
Гл.
о—р —
11
о
Рис. 3. Структуры:
(а) динуклеозидмонофосфата тимина (ТрТ); (б) тиминового динуклсотида (рТрТ); (в) поли-тимидиловой кислоты (ро1у-Т). По [Альберте, В., Д. Брей, Дж. Льюис, и др., 1986].
а) он
СУ
б)
он
Л
НО^ N
ЙГ
л
s
В)
он
лУ
СИ,
по
N
I
и
д)
£г
НО
е)
о
U хСНз
лУ
Рис. 4. Теоретически возможные таутомерные формы тимина: «е» - дикетоформа. По [Kwiatkowski, J.S., and В.Pullman, 1975].