СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВТМ - вирус табачной мозаики
ХВК - вирус X картофеля
Т - атом трития
М - молекула среды
RH - молекула углеводорода
Olefin - ненасыщенное органическое соединение
RX - производные углеводородов
R- радикал
Индексом * отмечены горячие частицы
IIRP - изофермент С пероксидазы из корней хрена
ТОР - пероксидаза табака
АРХ - аскорбатпероксидаза
ARP - пероксидаза Arthromyces ramosus
ССР - цитохром с пероксидаза
С1Р - пероксидаза Coprinus cinereus
PNP - пероксидаза арахиса
BP - пероксидаза ячменя
LIP - лнгниниероксидаза
МпР - марганец-иероксидаза
ВНА - бснзгидроксамовая кислота
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
ABTS ~ 2>2’-азино-6ис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония
RZ - ОТНОШеНИе ИОГЛОЩеНИЙ, A40J/A28O
Е - единица каталитической активности (рМ/мин)
PC А - рентгеноструктурный анализ ЯМР - ядерный магнитный резонанс
SDS-PAGE - электрофорез в присутствии додеци л сульфата натрия
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.....................................................5
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...........................................9
ГЛАВА 1. ПЕРОКСИДАЗЫ : СТРУКТУРА II МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА... 9
1.1. Классификация пероксид аз и реакционный цикл..........9
1.2. Структура иероксидаз и механизм расщепления перекиси водорода 10
1.3 Механизмы окисления донорных субстратов...............13
1.4 Эффекторные свойства ионов металлов...................15
ГЛАВА 2. МЕТОД РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТОВ.. 18
ГЛАВА 3. МЕТОД ТРИ П1 ЕВОЙ ИЛАНИГРАФИИ (ТЕРМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТРИТИЯ)...........................................24
3.1. Основы метода........................................24
3.2. Горячие атомы........................................26
3.3. Анализ меченых препаратов............................32
ГЛАВА 4. КОЫФОРМАЦИОННЫЕ ПЕРЕХОДЫ В БЕЛКАХ..................33
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................42
5.1. Реагенты и коммерческие препараты ферментов..........42
5.2. Препараты рекомбинантной лероксидазы хрена...........42
5.2.1. Конструкция плазмид и мутантов...................42
5.2.2. Получение препаратов рекомбинантной пероксидазы хрена 44
5.3. Методы, использованные в работе......................49
возвращает протон на связанный с аргинином гидроксил, образующий молекулу воды (рис. 1). Перераспределение электронов приводит к образованию фермента с оксиферрил-гемом и тг-катион-радикалом на порфириновом кольце, т.н. Соединения I. Участие дистальных остатков гистидина и аргинина в связывании и расщеплении перекиси водорода в активном центре пероксидазы хрена было подтверждено направленным мутагенезом этих остатков [12,13]
Молекула воды, обнаруженная в активном центре ИКР и ее комплексах с феруловой кислотой и цианидом, также присутствует в кристаллических структурах других пероксидаз растений [14]. Остаток пролина, кислород которого образует водородную связь с молекулой воды активного центра, присутствует во всех пероксидазах супсрсемейства растений. Основываясь на кристаллических структурах вышеупомянутых комплексов I1RP [14], авторы предложили механизм окисления субстратов с участием молекулы воды активного центра. Сначала Arg38 образует водородную связь с фенольным кислородом субстрата-восстановителя, что помогает переносу протона с фенольного кислорода на His42 посредством участия молекулы воды активного центра, удерживаемой в нужном положении водородной связью с кислородом Pro 139. Перенос электрона происходит на порфириновое кольцо гема. При воссгановлении Соединения И перенос протона, синхронный переносу электрона, может происходить через молекулу воды активного центра (рис. 2).
И
Arg3 8'
His42+*
\
HN = C(NH2)2 „Н
0
о
E + H202
Fe
3+
-> El + H20
Рис. 1. Участие дистальных остатков Arg и His в образовании молекулы воды
His42+
-■ Н—О
A Я*
Л ХД V !
HN = C(NH2)2 і I
6 \
X
Pro 139
Phe - R
Eli + S ->
РгоІ39
Рис. 2. Восстановление Соединений I (вверху) и II (внизу) фенольным субстратом, иллюстрирующее возможную роль молекулы воды активного центра
12
- Киев+380960830922