2
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................стр. 4
ВВЕДЕНИЕ стр. 5
Актуальность проблемы....................................стр. 5
Цель и задачи исследования стр. 7
Научная новизна работы стр. 7
Практическое значение работы стр. 8
Апробация диссертации crip. 8
Структура и объем диссертации стр. 9
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ стр. 9
Основные характеристики возбудителя и заболевания стр. 9
Систематика стр. 10
Патогенез стр. 10
Факторы патогенности сальмонелл стр. 12
Методы диагностики сальмонеллеза стр. 17
Традиционные методы типирования сальмонелл стр. 22
Основы генетического типирования бактерий стр. 25
Методы генетического типирования сальмонелл стр. 31
Факторы антибиотикорезистентности сальмонелл.............стр. 37
Вакцины из аттенуированных штаммол сальмонелл............стр. 41
Заключение............................................. стр. 42
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................стр. 44
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................стр. 44
1. Разработка тест-системы для выявления сальмонелл методом ПЦР...стр. 44
1.1 Выделение ДНК............................................стр. 44
1.2 Штаммы Микроорганизмов, использованные в работе стр. 45
1.3 Клинический материал, использованный в работе стр. 46
1.4 Определение предела аналитической чувствительности стр. 46
2. Молекулярно-генетическое типированис штаммов сальмонелл.....стр. 47
2.1 Штаммы микроорганизмов, использованные в работе..........стр. 47
2.2 Выделение ДНК............................................стр. 47
2.3 Анализ RAPD/RFLP.........................................стр. 48
2.4 Амплификация гена SpaO...................................стр. 48
2.5 Амплификация фрагментов гена invA........................стр. 48
2.6 Проведение филогенетического анализа стр. 49
3. Выявление мутаций резистентности к рифампицину и
стрептомицину стр. 49
3.1 Тестирование резистентности к антибиотикам...............стр. 49
3.2 Штаммы сальмонелл, использованные в работе...............стр. 49
3.3 Амплификация гена гроВ...................................стр. 49
3.4 Амплификация фрагментов гена rpsL.......................стр. 50
3
4. Детекция фрагментов ПЦР стр. 50
5. Определение концентрации ДНК стр. 50
6. Секвенированис ДНК.........................................стр. 51
7. Клонирование ДНК в фаг X стр. 51
7.1 Очистка фрагментов ПЦР стр. 51
7.2 Рестрикция фрагмента ПЦР стр. 51
7.3 Электрофорез, элюция фрагмента из геля..................стр. 52
7.4 Реакция лигирования стр. 52
7.5 Упаковка фаговых частиц стр. 52
7.6 Приготовление клеток Е.соН..............................стр. 52
7.7 Высев упакованных частиц фага стр. 53
7.8 Отбор клонов и элюция фаговых частиц....................стр. 53
7.9 Наращивание рекомбинантных фаговых частиц стр. 53
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ стр. 54
Глава 1. Разработка тест-системы дли выявления сальмонелл.....стр. 54
1.1 Выбор оптимальных параметров ПЦР стр. 54
1.2 Создание внутреннего контрольного образца ДНК (ВКО) стр. 56
1.3 Определение специфичности и чувствительности тест-системы стр. 58
1.4 Определение предела аналитической чувствительности гсст-
сисгемы.......................................................стр. 60
Глава 2. Молекулярно-генетическое типированис штаммов сальмонелл....................................................стр. 62
2.1 Генетическое типирование методом секвенирования ДНК.......стр. 63
2.2 Генетическое типирование методом КАРО/ЯГЕР................стр. 67
2.3 Выявление индивидуальных мутаций в ДНК вакцинных штаммов сальмонелл....................................................стр. 70
ОБСУЖДЕНИЕ....................................................стр. 75
ВЫВОДЫ........................................................стр. 83
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ......................................стр. 83
ЛИТЕРАТУРА....................................................стр. 85
ПРИЛОЖЕНИЯ....................................................стр. 102
10
Поздеев. -М.: ГЭОТЛР Медицина, 1998. - 1200с.]. Сальмонеллы могут не только сохраняться, но и размножаться в молоке, мясном фарше, яичном порошке и ряде других продуктов. Бактерии хорошо переносят низкие температуры, однако, быстро погибают при температуре свыше 46°С и практически мгновенно мри 100 °С.
Систематика
Продолжительное время господствовало мнение, что все микроорганизмы рода Salmonella принадлежат к одному виду S.enterica и их можно разделить по биохимическим признакам на семь групп: I, II, Ilia, Illb, IV, V и VI, именуя подвидами. Затем, Reeves при поддержке Brenner, Popoff и Le Minor предложил выделить группу V в отдельный вид S.bongori [Le Minor L., Popoff M.Y. 1987, Popoff M.Y., Bockemuhl J., McWhorter-Murlin A. 1994. Supplement 1993 (No.37)]. Таким образом, согласно современной
номенклатуре, род Salmonella состоит из двух видов: S.enterica и S.bongori.
Внуфи вида S.enterica выделяют 6 подвидов, соответствующих подродам по классификации Кауфмана: I- подвид enterica, 11- подвид salamae, Ilia- подвид arizonae, IHb- подвид diarizonae, IV- подвид houtenae, VI- подвид indica.
Основная масса сальмонелл, вызывающих заболевания человека и животных, принадлежит к подвиду I - enterica. Штаммы, принадлежащие к остальным подвидам, патогенны, как правило, для пойкилотермных животных, однако отмечено, что некоторые штаммы S.arizonae могут вызывать заболевания овец и птиц [OIE Manual 2000, р.832-842].
Патогенез
Сальмонеллез встречается как в виде отдельных спорадических случаев, так и в виде эпидемических вспышек.
Ряд аспектов патогенеза сальмонеллеза все еще остается неизвестным. Установлено, что для развития манифестных форм заболевания обязательно
11
проникновение в ЖКТ не только токсинов сальмонелл, но и живых возбудителей.
Патогенность сальмонелл в значительной степени связана с их высокой инвазивностыо. Основная масса живых бактерий, прошедших через желудок, попадает в кишечник и очень быстро внедряется в ткани тонкого кишечника. Значительная масса сальмонелл, оставшихся в просвете кишечника, быстро погибает под действием ферментов, и выводится вместе с фекалиями. При генерализации инфекции происходит накопление и размножение сальмонелл в мезентериальных узлах, селезенке и печени за счет способности сальмонелл паразитировать и размножаться в цитоплазме макрофагов [Jones B.D., Falkow S., 1996]. Процесс накопления сальмонелл в организме одновременно сопровождается их гибелью и распадом, а следовательно, и значительным выбросом токсинов, что знаменует собой конец инкубационного периода и начало синдрома интоксикации. Местная реакция на эндотоксин заключается в развитии неспецифического энтерита. Воспалительные явления в слизистой оболочке возникают после прохождения сальмонеллами через эпителиальный барьер и их захвата макрофагами и лейкоцитами. В результате этого происходит не только уничтожение сальмонел, но и гибель части фагоцитов и других клеток под действием эндотоксина и продуктов метаболизма сальмонелл, а также освобождение дополнительных порций токсинов, гистамина и прочих биологически активных веществ - серотонина, катехоламинов, кининов и др. Упомянутые медиаторы воспаления ведут к развитию энтерита путем активации аденилат-циклазной системы и стимуляции выброса простагландинов.
Общая реакция организма на эндотоксин харакгеризуется развитием нарушений функционально-адаптивных процессов во многих органах и системах. Под действием токсических веществ, происходит нарушение регуляторных функций нервно-эндокринной системы, изменяются обменные процессы, что отражается на деятельности пищеварительной и сердечно-
- Киев+380960830922