ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Эксперименты были выполнены на нейронах дорзальной поверхности подглоточного комплекса ганглиев улиток Helix pomatia и Helix lucorum taurica Kryn. Использование в отдельных исследованиях водного моллюска Lymnaea stagnalis будет указано при описании соответствующих методик.
Исследована активность изолированных нейронов: 24 - ППа1, 17 - ППа2, 22 - ППа7, 32 - В7. Опыты по аппликации веществ были проведены на 512 нейронах моллюска.
2.1. Методика внутриклеточного отведения биопотенциалов
Изолированное окологлоточное кольцо фиксировали за нервы посредством вольфрамовых игл в экспериментальной камере, дно которой было покрыто силиконовой резиной. Объем экспериментальной камеры был равен 0.5 мл, скорость смены растворов - 20 - 25 мл/час. После механического удаления наружной оболочки, подглоточный ганглий обрабатывали ферментом проназа E ("Sigma", США) в течение 45 минут с последующим промыванием раствором Рингера. Стандартный раствор Рингера для беспозвоночных, применявшийся во всех экспериментах, имел следующий ионный состав (в мМ): NaCl 100, KCl 4, CaCl2 10, MgCl2 4, ТРИС-HCl 10; рН 7.45. Изменения в составе раствора Рингера будут указаны при описании конкретных экспериментов.
В работе применяли стеклянные микроэлектроды с сопротивлением 10-30 МОм, заполненные 2.5 М раствором KCl.
Аппликация химических веществ выполнялась путем перфузии данного вещества в экспериментальную камеру и с помощью метода "фиксации концентрации" [116], который позволял быстро сменить внеклеточный раствор за 20 - 50 мс.
Использованные в работе растительные моно- и бисдесмозидные ТТГ (соединения 1 - 22 на рис. 3.9) олеаноловой кислоты (R2 = H) и хедерагенина (R2 = ОH) были выделены из растений семейства Araliaceae: 1 - 6, 13 - 17 из Hedera taurica [3 - 7, 29, 30, 47], соединения 9, 10, 20, 21 из Hedera colchica [10, 33, 84], 11, 22 из листьев Acanthopanax sieboldianus [148], гликозид 12 из Brassaia actinophilla [83] и 7, 8, 18, 19 из Fatsia japonica [95].
Бисдесмозидные ТТГ растворяли в стандартном растворе Рингера, а монодесмозидные, нерастворимые в воде соединения, предварительно переводили в натриевую соль при нагревании с добавлением 0.1 - 0.2 мл 2%-ного раствора Na2СO3 и доводили раствором Рингера до необходимых концентраций.
При регистрации электрической активности в нейроны вводили по одному микроэлектроду, которые были связаны с входными предусилителями. Электрическую активность нейронов регистрировали на быстродействующем чернильном самописце Н 338-6П и осциллографе CI-69 (Nihon Kohden, Япония). Для стимуляции нейронов током в клетку одновременно вводили два микроэлектрода: один - для регистрации МП, второй - для поляризации мембраны нейрона. В этом случае стимуляцию нейрона током производили через нагрузочное сопротивление 100 МОм с помощью изолирующего устройства стимулятора ЭСУ-2. Во время работы второй микроэлектрод был связан с выходом усилителя фиксации потенциала.
В качестве индифферентного электрода использовали электрод от рН-метра - ЭВЛ-IM3, заполненный насыщенным раствором КС1 и помещенный в отток раствора из экспериментальной камеры.
Микроэлектроды были связаны с электрической частью установки через солевой мостик и Ag-AgCl электрод. Введение микроэлектродов в нейроны осуществляли под контролем микроскопа МБС-2.
2.2. Изоляция нейронов
При изоляции нейронов ППа1, ППа2 и ППа7 сначала для точной их идентификации регистрировали фоновую электрическую активность, а затем извлекали микроэлектрод и перерезали коннективу между правым париетальным ганглием, где расположены упомянутые выше клетки, и висцеральным ганглием, куда направлены их главные отростки. Затем снова вводили микроэлектрод в одну из исследуемых клеток и, непрерывно регистрируя ее электрическую активность, с помощью микроманипулятора механически изолировали сому этого нейрона и извлекали ее из ганглия. Как правило, вместе с сомой извлекалась и часть аксодендритного дерева этой клетки, расположенного в правом париетальном ганглии.
При получении изолированных нейронов, пригодных для исследования методом фиксации потенциала, окологлоточный ганглий улиток Helix pomatia и Lymnaea stagnalis подвергали ферментативной обработке в пенициллиновом флаконе с раствором Рингера, в котором растворяли 3.5 мг/мл фермента проназы. Время инкубации составляло 45 минут, при температуре 370С. Раствор Рингера для водного моллюска содержал (в мМ): NaCl 44, KCl 1.7 или 0, CaCl2 2, MgCl2 4. Нормальная величина рН 7.8 поддерживалась с помощью буфера HEPES - NaOH (10 мМ). Этот же буфер использовался для изменения рН в пределах 5.3 - 8.1.
Далее ганглий промывали внешним раствором в течение 10 минут. С помощью острых стальных игл разрывали размягчившуюся оболочку, покрывающую правый париетальный и висцеральный ганглии, и при многоразовом пропускании указанных ганглиев через стеклянную пипетку (диаметр от 0.5 до 1 мм) получали изолированные нейроны.
2.3. Метод внутриклеточной перфузии в соединении с методом фиксации потенциала
Регистрация ионных токов через мембрану нейронов проводилась методом внутриклеточной перфузии [85, 110, 111] в модификации, которая позволяет использовать стеклянные микропипетки. Микропипетки изготавливались по методу Э. Неера и др. [131] из легкоплавких капилляров диаметром 1.8 мм. Диаметр кончика пипетки равнялся 2 - 4 мкм, сопротивление составляло 2 - 5 МОм. Для регистрации натриевых токов пипетки заполнялись внутриклеточным раствором (в мМ): CsF 40, ТРИС-НCl 12; pH 6.8; для регистрации калиевых - KCl 100, MgCl2 5, EGTA 5, HEPES - NaOH 10; pH 7.4.
Чашку Петри с изолированными в растворе Рингера нейронами помещали на неподвижный столик инвертированного микроскопа Leitz (Германия). В чашку под визуальным контролем опускали микропипетку, заполненную внутриклеточным раствором, и при помощи микроманипулятора приближали ее к выбранному нейрону при поддерживаемом пот