РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ОБСТЕЖЕННЯ ТА КЛІНІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ХВОРИХ З КРОВОТОЧИВОЮ ВИРАЗКОЮ ШЛУНКА ТА ДВАНАДЦЯТИПАЛОЇ КИШКИ
Поряд з загальноклінічними і інструментальними обстеженнями, всім хворим проводили вивчення загального аналізу крові, сечі, рівня глюкози в крові, вмісту загального білірубіну і його фракцій, АлТ, АсТ, лужної фосфатази, сечовини, креатиніну, стану згортальної і антизгортальної систем крові, ОЦК та ін. Показники цих досліджень використовувались для оцінки загального стану хворого, встановлення діагнозу та ступеня тяжкості крововтрати. Результати досліджень дозволяли доповнити і клінічно оцінити дані більш складних методів дослідження, за допомогою яких можна оцінити функціональний стан печінки.
2.1. Диск-електрофорез сироваткового білка в поліакриламідному гелі
Використання широко відомих методів визначення білкового обміну і кількісного вмісту сироваткових білків сьогодні не задовільняють вимог, які виставляються до вивчення характеристики функціональної здатності печінки при патологічних процесах.
Більш широку інформацію при вивченні цього питання можна отримати при визначенні фракцій сироваткового білка методом ДЕФ в ПААГ, спроможна здатність якого в багато разів перевищує інші методи розділення білків. На думку H.R.Мauer [311], цей метод більш як в 10 разів перевищує результати електрофорезу на папері та в агаровому гелі. Він дозволяє розділити сироватковий білок на 25-27 фракцій. ДЕФ сироваткового білка проводили в 7,5 % ПААГ на апараті угорської фірми "Reanal-69" за методом B.I. Davis [312].
Для кращої інтерпретації отриманих диск-електрофореграм використовували дрібнопористий гель довжиною 76 мм і крупнопористий - 8 мм. Матеріалом для дослідження були 200 мкг сироватки з крові, взятої з ліктьової вени пацієнта, яку змішували з таким же об`ємом 40 % сахарози. Електрофорез проводили впродовж 30 хвилин при режимі апарату 2 мА на одну пробу при напрузі 600 Вт. Пізніше впродовж однієї години силу струму збільшували до 5 мА. Після закінчення електрофорезу виймали гелеві колонки зі скляних трубок, проводили їхню фіксацію в 10 % розчині трихлороцтової кислоти впродовж 10 хвилин та фарбували в 0,1 % розчині амідочорного 10В 20 хвилин і промивали в 7 % розчині оцтової кислоти.
Диск-електрофореграми піддавали якісному і кількісному розшифруванню за допомогою запропонованого в клініці програмно-апаратного комп'ютерного комплексу оптоелектронного аналізу [125].
Загальну кількість білка сироватки крові визначали біуретовим методом.
2.2. Методика кількісного і якісного визначення Ig G, Ig A, Іg M у фракціях сироваткового білка диск-електрофореграми в поліакриламідному гелі
Вивчення кількісного вмісту Ig G, Ig A, Ig M за методом Manchini [313], яким користується більшість авторів, дає тільки орієнтовну оцінку гуморального імунітета при різних патологічних процесах, в тому числі, і при кровоточивій виразці, оскільки градієнт величин різних класів імуноглобулінів у здорових людей є досить широким, а зміни при патологічних процесах нерідко знаходяться в межах фізіологічних показників. Тому вивчення різних класів імуноглобулінів у фракціях сироватки крові дає можливість встановити глибокі порушення показників гуморального імунітету.
Виходячи з цього, поряд з вивченням загальної кількості Ig G, Ig А, Ig М в сироватці крові, ми визначали кількісні і якісні зміни різних класів імуноглобулінів в фракціях сироваткового білка диск-електрофореграми в ПААГ за методикою М.Д.Василюка [124].
Після проведення ДЕФ в 7,5 % ПААГ чотирьох проб сироваткового білка за методикою, описаною вище, одну гелеву колонку фарбували 0,1 % розчином амідочорного 10 В і після промивання встановлювали на шкалу фореграмометра для визначення локалізації і наявності фракцій в зоні повільних посттрансферинів диск-електрофореграми в ПААГ.
Зразки розігнаного білка диск-електрофореграми є ідентичними, тому незафарбовані диск-електрофореграми встановлювали на шкалу фореграмометра на місце зафарбованої та за допомогою ножа-приставки до фореграмометра розрізали на окремі диски, які відповідали певній білковій фракції. Диски окремих фракцій сироватки крові зони повільних посттрансферинів розміщували на чашку Петрі в суворій послідовності на віддалі 15 мм, заливали агаром "Діфко" з диспергованою моноспецифічною антисироваткою Ig G. В другу чашку на диски фракцій заливали дисперговану моноспецифічну антисироватку Ig A, в третю - Ig M. Після витримки всіх проб впродовж 72 годин у вологій камері при кімнатній температурі проводили фіксацію проб в 10 % трихлороцтовій кислоті і промивали в 7 % розчині оцтової кислоти.
В агарі, який залитий в чашках Петрі, навколо дисків фракцій, де зна-ходяться імуноглобуліни, виникали кільця імунодифузії різних діаметрів, які мали пряму залежність від кількості імуноглобулінів в цій фракції. Одночасно визначали загальну кількість імуноглобулінів в сироватці крові даного хворого за методом G.Manchini [313].
Вимірювали діаметр кільця імунодифузії кожної фракції, підносили їх величини до квадрату і сумували. Складали пропорцію:
, де:
Igф - кількість імуноглобулінів в окремій фракції;
Igз - загальна кількість імуноглобулінів сироватки крові в г/л;
Dф2 - квадрат діаметра кільця імунодифузії цієї фракції в мм2 ;
?D2 - сума квадратів в мм кілець імунодифузії всіх фракцій .
2.3. Методика визначення кількості Т- і В-лімфоцитів
Для визначення активності лімфоцитів до розеткоутворення ми використали дещо змінену методику реакції утворення розеток з еритроцитами барана і зимозаном Г.И.Гришиной, запропоновану в імунологічній лабораторії академіка Р.В.Петрова [314].
Готували розчин верографіну, для чого до 20 мл 76 % розчину ве-рографіну додавали 86,2 мл дистильованої води і 0,9 мл 0,1 N розчину NaOH ( pH 7,35 ).
Лімфоцити крові виділяли наступним чином. В силіконову пробірку з 2-3 краплями гепарину додавали 5 мл крові, взятої з ліктьової вени і відстоювали впродов