РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконана протягом 1998-2000 рр. Експериментальні дослідження проведено на кафедрі паразитології та рибництва ЛДАВМ ім. С.З.Ґжицького, гельмінтологічні дослідження - на коропах 2-х і 3-х річного віку спонтанно а також експериментально заражених філометроїдозом в рибницьких господарствах Львівської області. (таблиця. 2.1)
Таблиця 2 1.
Морфометрична характеристика досліджуваних риб
Вікові групи рибПоказникиL, смl, смСередня маса, гДвох річки (не заражені)22,9 ? 0,518,5 ? 0,5210,1 ? 10,5Двох річки (заражені)21,2?0,617,0?0,5200,0?15,0Трьох річки (не заражені)38,0?0,534,0?0,6650,0?30,0Трьох річки (заражені)35,0?0734,5?05603,0?25,0
Дослідження риб проводили методом повного паразитологічного розтину, розробленого І.І. Скрябіним (1928),[135, 136] і модифікованого стосовно до риб В.А. Догелем, 1933 р., [64] і Маркевичем (1950).[104] Для цитогенетичних та імунологічних досліджень в системі "паразит-хазяїн" при філометроїдозі коропа використовували як спонтанно, так і експериментально інвазованих коропів за методикою розробленою К.О. Вісманісом [43], В. М. Івасиком і співавторами [70]. Г.В. Васильковим [37]. Експериментальне перезараження циклопів личинками філометроїдес проводили в умовах лабораторії. Для цього за допомогою планктонної сітки відловлювали рачків-циклопів в ставках господарств, потім їх транспортували у аерованих поліетиленових тобинках у акваріум лабораторії кафедри. Далі із хворих риб видаляли з лусочкових кишеньок самок філометри, у яких в матці були активно рухливі личинки. Видалених самок поміщали в акваріум, де знаходились циклопи. Самки тріскали і личинки виходили у воду, де їх поїдали рачки. Уражених циклопів витримували в акваріумі протягом 15 днів для того, щоб личинки пройшли линьку і стали інвазійними. Дво - і трьохрічок коропа заражали інвазованими циклопами за допомогою сечостатевого катетера приблизно 80-100 інвазованих циклопів на рибу. Сформовані групи дослідних і контрольних риб перебували в однакових умовах утримання (t° - 18-20°C; O2 - 4-6мг/%; жорсткість - 16°Т). На 7-у, 15-у, 21-у, 30-у, 60-у добу міграції личинок у дослідних і контрольних груп риб відбирали проби крові і таких органів як: селезінка, нирки, зябра, лімфоїдний орган, кишечник. Вивчали мітотичну активність цих органів та рівень в них патологічних мітозів. Для цього ми готували тиснені препарати модифікованим методом, беручи за основу методики С.Е.Ford, J.L.Hammerton [177] та В.Н., Блюмкіна і В.М.Жданова [ 28 ], які були розроблені для теплокровних. Кусочки нирок, зябер, селезінки і кишечника поміщали в 0,8%-ний NaCl для того, щоб відмити кров, далі в 0,3%-ний KCl на 25 хв., потім в суміш етанол-льодова оцтова кислота - 3 : 1 (фіксатор Кларка) із 3-х разовою заміною через кожних 30 хв. Кусочки органів клали на чисті охолоджені предметні скельця і готували з них тиснені препарати, потім Їх висушували над полум'ям спиртівки і після вистигання піддавали рутинному фарбуванню за Гімза-Романовським протягом 30 хв. Потім промивали під струменем води і просушували. Підраховували під мікроскопом по 1000 клітин, які ділились і не ділились із кожного органу. Висновок про мітотичну активність робили за кількістю клітин, що знаходяться в поділі на різних фазах мітозу і за показником коефіцієнта фаз - відношення суми профаз-метафаз до суми анафаз і телофаз. Мітотичний індекс визначали за формулою:
де МІ - мітотичний індекс;
П - кількість профаз;
М - кількість метафаз;
А - кількість анафаз;
Т - кількість телофаз;
N - загальна кількість підрахованих клітин.
Для дослідження частоти та спектру хромосомних аберацій у соматичних клітинах органів коропа застосували авторський метод, який був запатентований як "спосіб виготовлення прямих метафазних хромосом риб" №34814А. Суть його полягає в тому, що коропам в черевну порожнину вводили 0,1%-ий розчин колхіцину з розрахунку 0,5 мл на 100 гр. маси. Через 4-5 годин з риб добували лімфоїдний орган і нирки. Ці органи переносили у флакони з гіпотонічним розчином (0,3%-ий KCl та 0,9%-ий цитрат натрію у співвідношенні 1 : 1) та інкубували 20 хв. при кімнатній температурі. Потім їх гомогенізували та ресуспедували у свіжій порції гіпотонічного розчину. Одержану суспензію клітин фільтрували через 2 шари марлі з метою очищення її від строми. Потім цю суспензію інкубували в гіпотонічному розчині 30 хв. при кімнатній температурі. Після інкубації її переносили в центрифужні пробірки і центрифугували на протязі 7 хв. при 1,5 тисяч обертів за хв. Супернатант (надосадову рідину) обережно відсмоктували, осад ресуспендували і додавали фіксуючу суміш: етанол-льодяна оцтова кислота у співвідношенні 3:1. Суспензію витримували в холодильнику 30 хв., центрифугували, супернатант обережно відсмоктували піпеткою і додавали свіжу порцію фіксатора. Потім після третьої заміни фіксатора супернатант відсмоктували, лишаючи в пробірці біля 1 мл осаду. Препарати метафазних хромосом коропа готували методом розкрапування суспензії клітин з висоти 15-20 см на знежиренні вологі охолоджені предметні скельця. Їх підсушували в полум'ї спиртівки, фарбували 2%-им розчином фарби Романовського-Гімза протягом 10 хв. фарбу змивали проточною водою, після чого препарат висушували. Від кожної риби аналізували по 100 рутинно зафарбованих метафазних пластинок із кожного органу. Облік аберацій метафазних хромосом проводили згідно рекомендацій ВОЗ (Женева, 1980).
У цих та інших мікроскопічних дослідженнях використовували мікроскоп Jenamed-2 (Karl Zells Jenna). Фотографії робились на плівку "Мікрат 300" за допомогою мікрофотонасадки МФН 11 при збільшенні 40Х; і 100Х.
Для гематологічних та імунологічних досліджень шприцом з голкою брали кров із хвостової артерії. З краплі цієї крові робили мазок. Кров, що залишилась виливали у пробірки, де шляхом відстоювання отримували нативну сироватку.
Для дослідження впливу міграції личинок на геном коропа використовували коро