РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
1.2. Групування дослідів
Для вирішення поставлених задач були проведені експериментальні дослідження на крові донорів віком 25-31 рік, лініях клітин HPB-ALL (Т-клітинний гострий лімфобласний лейкоз) і BJAB (лімфома Беркіта) та на 24 білих статевозрілих мишах лінії BALB/c масою 15-25 г.
Лабораторних тварин утримували в умовах віварію на стандартному раціоні харчування у відповідності з "Стандартными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)".
Для дослідження впливу комплексу пептидів тимуса - тималіну (Россия, Санкт-Петербург, ЗМП) та природного пептидного комплексу нирок (ППКН) [105] на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов тварини було розділено на такі групи: 1 група - інтактна; 2 - контрольна (тваринам внутрішньом'язово вводили 0,05 мл стерильного фізіологічного розчину натрію хлориду); 3 та 4 групи - дослідні (тваринам внутрішньом'язово вводили 0,1 мг/кг тималіну та 0,1 мг/кг ППКН відповідно) протягом 5 днів.
Кров тварин забирали шляхом декапітації під ефірним наркозом.
Для подальшого вивчення дії тималіну та ППКН на процеси апоптозу дослідження проводили на лімфоцитах периферійної крові донорів.
У людей забір крові проводили натщесерце за допомогою одноразових пластикових шприців із кубітальної вени в силіконовані пробірки для центрифугування з розчином гепарину (25 ОД на 1 мл крові). Суспензію лімфоцитів отримували шляхом інкубації при 370С протягом 1 години з додаванням 1,8% розчину декстрану (Fluka) у співвідношенні 2:1, із наступною дворазовою відмивкою фізіологічним розчином (15М натрію хлориду) та подальшим ресуспензуванням. Кількість клітин у суспензії при підрахунку [120] у камері Горяєва складала в середньому 4-7х106/мл клітин.
Для подальшого дослідження суспензію клітин інкубували в середовищі RPMI-1640 (Gibco BRL) із додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (BioMark), 10мМ HEPES (SIGMA, USA) і 100 мкг/мл гентаміцину сульфату (ГНЦЛС, Україна) при 370С протягом 24 годин.
У відповідності до завдань роботи ми досліджували вплив комплексів пептидів тимуса - тималіну (Россия, Санкт-Петербург, ЗМП) та природного пептидного комплексу нирок (ППКН) [105] на процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов.
Комплекс пептидів тимуса - тималін та ППКН використовували в кінцевій концентрації 0,12 мкг/мл у суспензії клітин, що була встановлена в попередніх дослідженнях як мінімальна ефективна доза [110]. Розчини пептидів готували в концентрації 1,2 мкг/мл, що додавали до суспензії клітин, до кінцевої концентрації 0,12 мкг/мл.
Для дослідження молекулярних механізмів дії пептидного комплексу тимуса - тималіну і ППКН використовували індуктори та інгібітори внутрішньоклітинних регуляторних систем, що беруть участь в розвитку процесів апоптозу (протеїнкіназа С, іони кальцію, вміст циклічних нуклеотидів) [121], а також можуть бути задіяні в реалізації ефектів біологічно активних речовин [122].
Активацію протеїнкінази С проводили шляхом додавання до суспензії клітин 4-форбол-12-міріст-13-ацетат (ФМА) (SIGMA, USA), активатора протеїнкінази С [10].
Внесення ФМА активує дію протеїнкінази С, що фосфорилює в присутності кальцію залишки серину і треоніну внутрішньоклітинних білків.
В культуральне середовище вносили ФМА в кінцевій концентрації 8,1 x 10-9 M та інкубували 24 години при 370С.
Проникнення іонів кальцію всередину клітини індукували шляхом додавання до суспензії клітин кальцієвого іонофору А23187 (SERVA) [10].
Кальцієвий іонофор А23187 може утворювати в гідрофобній фазі комплекси з кальцієм. Внесення іонофору опосередковує електронейтральний трансмембранний перенос двовалентного катіону (Ca2+) на інший двовалентний катіон або два протони. В культуральне середовище вносили кальцієвий іонофор А23187 у кінцевій концентрації 2 x 10-7 М та інкубували 24 години при 370С.
Блокаду внутрішньоклітинного кальцію здійснювали шляхом додавання до суспензії клітин 1,2-біс(амінофеноксі)етан-N,N,N',N'-тетраацетіл (ВАРТА) ('' ICN Biomedicals", USA) [10].
ВАPТА має гідрофобні властивості, тому здатний проникати всередину клітини і зв'язувати внутрішньоклітинний кальцій. В культуральне середовище вносили ВАРТА в кінцевій концентрації 5 x 10-3 М та інкубували 24 години при 370С.
Блокаду зовнішньоклітинного кальцію здійснювали шляхом додавання до суспензії клітин етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) (SERVA) [110].
ЕДТА здатна створювати комплексні з'єднання з іонами кальцію та магнію в екстрацелюлярному середовищі. В культуральне середовище вносили ЕДТА в кінцевій концентрації 2,5 x 10-2 M та інкубували 24 години при 370С.
Зараз глюкокортикоїди найбільш широко використовують для індукції апоптозу. Дію глюкокортикоїдів вивчали при додаванні до суспензії клітин дексаметазону (SIGMA, USA) [10].
Глюкокортикоїди пасивно проникають через клітинну мембрану, зв'язуються з глюкокортикоїдними рецепторами й активують їх. Останні прямим чи непрямим шляхом регулюють транскрипцію певних генів або, індукуючи "роботу" гена, або репресують її. В культуральне середовище вносили дексаметазон у кінцевій концентрації 10-7М та інкубували 24 години при 370С.
Накопичення в клітинах цАМФ здійснювали шляхом додавання до суспензії клітин теофіліну (SIGMA, USA) [123].
Теофілін інгібує фосфодіестеразу, що веде до накопичення в тканинах циклічного 3', 5-аденозинмонофосфату (цАМФ). В культуральне середовище вносили теофілін у кінцевій концентрації 10-3 M та інкубували 24 години при 370С.
З метою поглибленого вивчення процесів апоптозу лімфоцитів периферичної крові за фізіологічних умов та при активації їх внутрішньоклітинних регуляторних систем нами були проведені дослідження
в модельних дослідах, що узагальнені в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Схема дослідів
№ серіїЕкспериментальна модельКінцева концентрація речовин на 1 мл суспен
- Киев+380960830922