РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ТА МАТЕРІАЛИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти та моделі дослідження
Роботу виконано на 274 щурах – самцях лінії Вістар масою 180–200 г, одержаних з
розплідника ІФТ АМН України в осінньо-зимовий період. Під час проведення
експерименту всі тварини знаходилися на стандартному раціоні живлення віварію
згідно з “Санітарними правилами по устаткуванню, обладнанню та утриманню
експериментально-біологічних клінік (віваріїв)” [125]. Експериментальні та
контрольні групи щурів складалися з урахуванням віку, ваги та статі тварин.
Однойменні втручання завжди виконувалися в один і той самий час доби. При
проведенні кожної серії експериментів одночасно досліджували і контрольну групу
тварин (табл. 2.1). З експерименту тварини виводилися в уранішній час, під
етамінал-натрієвим наркозом.
Гіпоксія моделювали в гострому експерименті, який полягав в заміщенні профузної
гострої крововтрати розчином Рінгера-Локка. Оксигенацію розчину проводили в
апараті оригінальної конструкції (раціоналізаторська пропозиція № 1667 від
31.12.2001, ЗДМУ), який дозволяє доводити рівень рО2 до 1600 – 2000 мм рт. ст.
Аналіз газів проводився в біохімічній лабораторій Запорізької обласної
клінічної лікарні на апараті фірми Radiometr ABL 505. О2 в апарат надходив під
тиском 3-3,5 атм. Подача О2 проводилася протягом 20 хвилин, після чого розчин
був готовий до використання. Інфузія проводилася з розрахунку зразкового рівня
ХОК для щура – 3,2 мл/хв·г маси тварини [18, 89]. Дозування розчину проводилося
за допомогою перистальтичного насосу.
Опис експерименту. У тварин під єтамінал-натрієвим наркозом проводили
лапаротомію з виділенням черевної аорти і нижньої порожнистої вени. Вену
катетеризували для проведення інфузії серця, а аорту – для кровопускання [109].
Через хвилину після початку кровопускання проводили інфузію розчину
Рінгера-Локка. Катетер проводили до грудної порожнини, так що розчин потрапляв
безпосередньо в праве передсердя. Тварин забивали через 3 і 6 хвилин після
початку інфузії розчину. Ці часові проміжки вибрані, виходячи з методики оцінки
варіабельності ритму серця, для якої необхідний обсяг запису скорочень серця
протягом 3 хвилин (більше 500 R-R).
Всі тварини були розділені на шість (табл. 2.1) дослідних груп: 1 – з інфузією
розчину Рінгера-Локка; 2 – з інфузією оксигенованого розчину Рінгера-Локка; 3 –
з інфузією розчину Рінгера-Локка з тіотриазоліном; 4 – з інфузією
оксигенованого розчину Рінгера-Локка з тіотриазоліном; 5 – з інфузією розчину
Рінгера-Локка з румосолом; 6 – з інфузією оксигенованого розчину Рінгера-Локка
з румосолом.
Обидва АО синтезовано в нашому ВУЗі, але якщо тіотриазолін вже давно успішно
використовується в клініці, то румосол знаходиться на стадії доклінічної
апробації і наша робота є однією з дослідницьких робіт цього рівня. Крім того,
біохімічні дослідження проводилися і у групі інтактних тварин.
При проведенні досліджень спочатку була проведена оцінка об'єму вибірки,
достатньої для оцінки статистичної значущості можливих відмінностей. Оцінку
проводили за допомогою статистичного пакету «Biostat» за достатньо жорстких
умов: рівень довірчої вірогідності для перевірки гіпотези вибирався рівним
0,95, надійність тесту встановлювалася рівній 0,8. Виходячи з припущення про
те, що встановлювана відмінність перевищує середньоквадратичне відхилення в
двічі, рекомендований об'єм вибірки nі6.
Таблиця 2.1
Серії експериментів та кількість тварин, що використовувались в експерименті
Методика
Експериментальна серія з інфузією різних розчинів
Кількість тварин
Визначення ЧСС, ВРС на 3 і 6 хвилинах інфузії
інтактна
Рінгера-Локка
оксигенований Рінгер-Локка
Рінгер-Локка з тіотриазоліном
Рінгера-Локка з румосолом
оксигенований Рінгера-Локка з тіотриазоліном
оксигенований Рінгера-Локка з румосолом
Визначення в тканинах серці концентрації продуктів ВРО
інтактна
Рінгера-Локка
оксигенований Рінгера-Локка
Рінгера-Локка з тіотриазоліном
Рінгера-Локка з румосолом
оксигенований Рінгера-Локка з тіотриазоліном
оксигенований Рінгера-Локка з румосолом
Визначення в тканинах серці активності ферментів АОЗ
інтактна
Рінгера-Локка
оксигенований Рінгера-Локка
Рінгера-Локка з тіотриазоліном
Рінгера-Локка з румосолом
оксигенований Рінгера-Локка з тіотриазоліном
оксигенований Рінгера-Локка з румосолом
Продовж. табл. 2.1
Методика
Експериментальна серія з інфузією різних розчинів
Кількість тварин
Визначення в тканинах серці активності КФК
інтактна
Рінгера-Локка
оксигенований Рінгера-Локка
Рінгера-Локка з тіотриазоліном
Рінгера-Локка з румосолом
оксигенований Рінгера-Локка з тіотриазоліном оксигенований Рінгера-Локка з
румосолом
Ферментативне визначення антиоксидантної активності (АОА) in vitro
Рінгера-Локка
оксигенований Рінгера-Локка
Рінгера-Локка з тіотриазоліном
Рінгера-Локка з румосолом
оксигенований Рінгера-Локка з тіотриазоліном
оксигенований Рінгера-Локка з румосолом
Рінгера-Локка з емоксипином
оксигенований Рінгера-Локка з емоксипином
8
2.2. Біохімічні методи дослідження
Виділення і підготовку біологічного матеріалу до біохімічних досліджень
проводили за стандартними методиками [93].
Усі процедури з виділення субклітинних фракцій тканин виконували на холоді, при
температурі повітря лабораторного приміщення від 0 до +4 °С. Інструменти для
дослідів були також охолодженими.
Серця ретельно відмивали від крові, обполіскували кілька разів в охолодженому
0,9% розчині KCl, а потім обсушували фільтрувальним папером. Серця поміщали на
льод в чашку Петрі і ножицями видаляли судини, залишки сполучної тканини і
жиру, згустки крові, а потім ще раз обполіскували охолодженим 0,9% KC