РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи постановки експериментів та вивчення біохімічних показників у
лабораторних тварин
Експерименти проведено на мишах-самках лінії C57Bl розведення віварію ІЕПОР
НАНУ ім. Р.Е.Кавецького (м. Київ), вагою 20 г, із підшкірно перещепленою
аденокарциномою молочної залози Са 755. Експеримент було розпочато на 14 добу
після перещеплення. Мишей було розподілено на 5 терапевтичних груп, по 5 мишей
в кожній. Тварини першої групи знаходились в звичайних світлових умовах і
служили першим контролем. Миші другої групи, протягом експерименту, знаходились
в умовах цілодобової темряви та були другим контролем. Третя група тварин
знаходилась в умовах звичайного фотоперіода та отримувала внутрішньоочеревино
мелатонін (Латвія, “OlainFarm”) – 40 мг/кг 3 рази на добу з інтервалом 4
години. Миші четвертої групи знаходились в звичайних умовах освітлення,
отримували внутрішньоочеревно поліхіміотерапію за схемою CMF: циклофосфан
(Латвія, “OlainFarm”) – 25 мг/кг, кожного дня протягом всього експерименту,
метотрексат (Австрія, “Ebewe”) – 10 мг/кг та 5-фторурацил (Україна, “Дарниця”)
– 154 мг/кг у перший та восьмий дні експерименту, та мелатонін, як описувалось
вище. П’ята група мишей цілодобово знаходились в умовах темряви (маніпуляції
проводились в умовах слабкого червоного світла тривалістю до 10 хвилин на добу)
та отримували внутрішньоочеревно ПХТ за схемою CMF, за методикою, що описана
вище.
По закінченню експерименту тварин п’яти груп забивали та проводили забір тканин
печінки та нирок, які негайно заморожували та зберігали в рідкому азоті.
Безпосередньо перед біохімічним дослідженням взірці тканини подрібнювали в
рідкому азоті до гомогенного стану та визначали вміст в них малонового
діальдегіду (МДА), відновленного глутатіону (GSH) та активність
глутатіон-S-трансферази (GST).
У тварин першої та другої групи, окрім вищевказаних вимірів, проводили
визначення показників маси (абсолютної та відносної) та клітинності (загальної,
на 1 мг маси органу, відсоток життєздатних клітин) тимусу, селезінки,
лімфовузлів (4 пахвових, 2 пахових, 2 підколінних – всього 8), популяційного
складу лімфовузлів та активності макрофагів (МФ) (в НСТ-тесті).
Статистичний аналіз отриманих експериментальних даних проводився на ПЕОМ за
методами варіаційної статистики з використанням пакету програм статистичної
обробки даних токсикологічних та фармакологічних експериментів [15].
З метою встановлення впливу М на гомеостаз у лабораторних тварин було вивчено
біохімічні та імунологічні показники.
1) Біохімічні показники
Концентрацію МДА визначали за допомогою тіобарбітурової кислоти, реагуючи з
якою МДА утворює триметиновий комплекс, що флуоресцює, з максимумом поглинання
535 нм [40]. Визначення вмісту відновленного глутатіону проводили за допомогою
дитіонітробензойної кислоти спектрофотометричним методом [71]. Метод визначення
активності глутатіон-S-трансферази базується на взаємодії GST із субстратом –
1-хлор-4,6-динітробензолом, результатом якої є утворення продукту, що
максимально поглинається при 340 нм [130]. Показники концентрації GSH та
активності GST розраховуються по відношенню до кількості білка, що передбачає
визначення його вмісту в досліджуванних зразках тканин, останнє було проведено
за методом Лоурі [172].
2) Імунологічні показники
На торсійних терезах визначали абсолютну масу органів та розраховували показник
відносної маси кожного з них (у % від маси тіла).
Органи розтирали в гомогенізаторі Поттера в живильному середовищі 199, яке
містило 10 % сироватку великої рогатої худоби. Клітини центрифугували при 1,5
тис. об/хв протягом 10 хв. Суспензію клітин, виділених із селезінки, додатково
обробляли 0,83 % розчином NH4Cl для лізису еритроцитів впродовж 6 хв, після
чого тричі відмивали від NH4Cl у середовищі 199 (1,5 тис. об/хв, 10 хв).
Підрахунок кількості життєздатних лімфоцитів, вилучених із кожного органу,
проводили за стандартною методикою, використовуючи суправітальне фарбування
трипановим синім. Розраховували вміст клітин на 1 мг маси органа та відсоток
життєздатних клітин.
Визначали субпопуляційний склад суспензій клітин із лімфатичних вузлів.
Препарати для цитологічного дослідження готували методом висушених краплин із
суспензій, які містили по 4-5ґ106 клітин/мл, за методом висушених краплин та
фарбували за методом Штокінгера-Келльнера 1 % розчином метиленового синього з
наступним диференціюванням у цитратному буфері Зеренсена (рН 4.96). Проводили
мікроскопію 1000 клітин, підраховуючи Т- (макро-) та В- (мікронуклеолярні)
лімфоцити, лімфобласти і великі лімфоцити, а також інші клітинні елементи
[45].
Активність макрофагів визначали в НСТ-тесті. Останні вимивали на 14-ту добу із
черевної порожнини за стандартним методом [207]. Готували суспензії клітин
(4ґ106 в мл) у живильному середовищі 199, яке містило 10 % сироватку великої
рогатої худоби, змішували рівні об’єми (по 0,1 мл) таких суспензій і розчину
нітросинього тетразолію (“Chemapol”, Чехія), інкубували проби 40 хв при 370С та
20 хв при 20-210С, клітини концентрували центрифугуванням. З осаду готували
мазки, які фарбували за методом Романовського. У кожному мазку підраховували
100 макрофагів, диференціюючи їх на такі групи: 0 – клітини без гранул
діформазану; 1 – 5-7 гранул у цитоплазмі; 2, 3 – гранули займали менше 30 –
50 % цитоплазми, відповідно; 4 – цитоплазма заповнена гранулами на 50-100 %,
ядро контуроване; 5 – ядро не конкурується (100 %-кова заповненість гранулами).
Цитохімічний показник активності (ЦПА) розраховували за формулою:
ЦПА =
Sав
100
де: а – порядковий номер групи,
в – кількість кліти
- Киев+380960830922