РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Клиническая характеристика больных
Материал диссертации представляет результаты обследования 383 больных РЯ, находившихся на обследовании и лечении в поликлиническом и гинекологическом отделениях ХОКОД с 2001 по 2006 г. Контрольную группу составили 50 больных с доброкачественными опухолями яичника.
Возраст больных колебался от 32 до 79 лет, а средний возраст составил 51,9?2,2 года. Во всех исследуемых случаях диагноз был верифицирован морфологически. Среди обследованных преобладали больные РЯ в возрасте 51-60 и 61-70 лет, удельный вес которых составил 57,9%, а больные до 40 лет составили 17,3%. Сроки наступления менархе составили 13,3?1,4 года у больных и 13,1?2,5 года у женщин контрольной группы. Анализируя частоту наследственной предрасположенности к раку, с учетом первой и второй степени родства, у анализируемой группы больных РЯ нами установлено следующее - 76 (19,8%) больных имели отягощенный онкологический анамнез.
Комплексное обследование больных и женщин контрольной группы включало гинекологический осмотр, цитологическое обследование мазков из шейки, полости матки и асцитической жидкости, гистологическое исследование операционного материала, трансвагинальное УЗ-исследование органов малого таза, определение СА 125 и ФНО-? в крови. У всех женщин собирали анамнез болезни, выясняли особенности менструальной, репродуктивной, половой функций.
Стадии злокачественного процесса классифицировали по TNM (2003 г.) [82.] и FIGO (1997 г.) [75].
Распределение больных РЯ в зависимости от стадии заболевания представлено в табл. 2.1.
Таблица 2.1
Распределение больных РЯ в зависимости от стадии заболевания
Обследуемые
группыКоличество больных,
абс/%1. Рак яичника I ст.
Т1а-с N0 M0256,42. Рак яичника IIст.
Т2а-сN0 М0-16517,03. Рак яичника III ст.
Т2-3 N0-1 М016743,54. Рак яичника IV ст.
Т1-3 N 0-1 М112632,95. Всего
Т1-3 N0-1 M0-1383100
Как видно из приведенных в таблице данных, преобладали больные с III ст. заболевания, несколько реже была IV ст., а наименьшую группу составили больные с I ст. РЯ.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Метод исследования концентрации ФНО-? в крови больных рака яичника. Исследование ФНО-? в сыворотке крови проводили иммуноферментным методом [81] с использованием набора реагентов ProCon TNF производства ООО "Протеиновый контур" (С.-Петербург) у 285 женщин: 235 больных РЯ, 50 больных с ДОЯ (серозными цистаденомами яичников).
Принципы анализа состояли в следующем. В наборе ProCon IF2 plus для измерения уровня ФНО-? использовали твердофазный иммуноферментный метод с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента ?57?. Один тип моноклональных антител иммобилизован на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекулы ФНО-? находится в наборе в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом является конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим очень высокое сродство к биотину. После инкубации и промывки в ячейки вносили конъюгат пероксидазы со стрептавидином, вновь инкубировали, промывали, вносили субстрат и измеряли активность связанной пероксидазы с использованием автоматического фотометра для микропланшетов [81]. Исследования проводили в лаборатории "Вирола" ХМАПО (зав. лаб. Кульшин В.Е.).
Комплект для постановки методики включал:
1. 1 разборный планшет с иммобилизованными антителами (6 стрипов по 16 ячеек в каждом).
2. Стандартные образцы ФНО, 5 флаконов, жидкие.
3. A - 500 пкг/мл; B - 250 пкг/мл; C - 100 пкг/мл; D - 50 пкг/мл; E - 0 пкг/мл.
4. Моноклональные антитела (АТ-2) биотинилированные, 20-кратный концентрат, 0,55 мл.
5. Конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, 10-кратный концентрат, 2 мл, разводить в буфере С.
6. Буфер С для разбавления образцов и конъюгата, 5-кратный концентрат, 12 мл.
7. Буфер B для промывки планшетов, 10-кратный концентрат, 2 х 22 мл.
8. 1N серная кислота, 6 мл.
9. Реагент, 1 флакон, 12 мл (ТМБ).
10. Субстрат, 1 флакон, 12 мл (H2O2).
11. Прецизионные микропипетки на 10, 25, 200 и 1000 мкл.
12. Шейкер-инкубатор на 37?С.
13. Фотометр для микропланшетов с длиной волны 450 нм.
Анализ проводился с использованием неразбавленных образцов сыворотки крови.
Протокол анализа.
1. Готовили план разбавления, распределения и идентификации.
2. Готовили буферные растворы: на 1 стрип 50 мл буфера для промывки и 8 мл буфера для образцов и конъюгата.
3. Отбирали необходимое количество стрипов.
4. Дважды промывали лунки буфером для промывки и один раз - дистиллированной водой, внося по 300 мкл в каждую лунку и проводя полную аспирацию жидкости.
5. Разбавляли 1:20 необходимое для анализа количество биотинилированных АТ-2 буфером для образцов и конъюгата из расчета 1.6 мл готового раствора на 1 стрип. Хорошо перемешивали полученный раствор вращательными движениями.
6. Растворяли содержимое ампул со стандартными препаратами, внося по 1 мл буфера для образцов в каждую.
7. В ячейки планшета A1-D1 и(или) A2-D2 вносили по 100 мкл стандартов ФНО, в ячейки E1 и(или) E2 внести по 100 мкл буфера С (нулевая проба).
8. В оставшиеся ячейки микропланшета вносили исследуемые образцы в объеме 100 мкл.
9. Инкубировали 1 час при +37?С при непрерывном встряхивании.
10. Удаляли жидкость из ячеек и трижды промыть их буфером В и два раза дистиллированной водой (300 мкл на одну ячейку). Проводили полную аспирацию оставшейся жидкости.
11. Пипеткой вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора вторых антител.
12. Инкубировали 2,0 ч при комнатной температуре или 1,0 ч при 37?С при непрерывном встряхивании.
13. Удаляли жидкость из ячеек, трижды промывали их буфером В и два раза - дистиллированной водой (300 мкл на одну ячейку). Проводили полную аспирацию оставшейся жидкости.
14. Разбавляли 1:20 необходимое для анализа количество конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена