РАЗДЕЛ 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В соответствии с целью работы, направленной на установление эффективности действия уреидооксамидов на процессы обмена острофазных белков, внутриклеточных ферментов и липидов, выбирали методы исследований. Перед биохимическими исследованиями химические структуры органических молекул уреидооксамидов были исследованы с помощью компьтерной программы "PASS", с целью выявления предполагаемых биологических активностей. Программа "PASS" фиксирует наличие тех или иных активных химических группировок, входящих в состав соединения, и предполагает их действие на биохимические процессы в клетках, основываясь на данных по влиянию на метаболизм лекарств, ядов и других известных веществ. Эта программа анализирует каждую выявленную активную химическую группировку в отдельности, при метаболических превращениях, при расщеплении этих групп, при объединении соединений и их групп с иными метаболитами в процессе окислительно-восстановительных реакций. Анализирование происходит на основе сопоставления с известными эффектами соединений, применяемых для регулирования процессов метаболизма у животных и людей. В связи с этим для уреидооксамидов может быть предсказано большое число возможных активностей, проявляющихся с разной силой (слабой, средней, выраженной). Теоретические компьютерные предположения могут быть подтверждены или опровергнуты в экспериментах на животных [123,180, 260,273,286,302,303].
Проверку наличия у уреидооксамидов антивоспалительных и антиокси-дантных свойств осуществляли в экспериментах на белых крысах, широко используемых учеными с аналогичной целью [86,221,269,316].
При изучении влияния уреидооксамидов на процессы обмена остро-фазных белков, ферментов и липидов в сыворотке крови определяли содержание альбумина, гаптоглобина, церулоплазмина, фибриногена (в плазме), общего белка, средних молекул, общих липидов, холестерина, ЛВП-холестерина, МДА, активность АлАТ, АсАТ, ЩФ, КФ и каталазы.
Концентрацию альбумина определяли унифицированным методом, основанном на взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым, когда в слабокислой среде в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс, оптическая плотность (ОП) которого пропорциональна концентрации альбумина в сыворотке крови. Использовали реактивы фирмы "Агат" (Россия). ОП определяли на биохимическом анализаторе "Stat Fax 0904" при длине волны 625 нм (620-630 нм) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя 1см [83, 122, 153].
Определение концентрации гаптоглобина проводили по гемоглобино-связывающей способности сыворотки крови, когда добавленный к сыворот-ке крови гемоглобин связывается гаптоглобином. О содержании гаптогло-бина судят по остатку несвязавшегося гемоглобина, который определяли фотометрически на КФК-3 при длине волны 530 нм в кювете 1см против дистиллированной воды (ДВ) [84, 153].
Определение церулоплазмина проводили по методу Равина, в котором церулоплазмин окисляет р-фенилендиамин с образованием окрашенного в сине-фиолетовый цвет продукта реакции.
Реактивы. 1. Раствор р-фенилендиамина - 5,0 г/л на ДВ. Готовить из перекристаллизованного реактива непосредственно перед использованием. 2. Ацетатный буфер - 0,4 моль/л, рН 5,5: смесь растворов ацетата натрия 0,4 моль/л и уксусной кислоты 0,4 моль/л в отношении 9:1. 3. Раствор гидроксиламина солянокислого - 5,0 г/л на ДВ.
Ход определения. В пробирки вносили по 0,1 мл сыворотки. В одну из пробирок, служащую контрольной, добавляли 1,0 мл раствора гидроксиламина солянокислого (с целью инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем во все пробирки помещали по 8,0 мл ацетатного буфера, перемешивали и инкубировали 5 мин. при температуре 37?С. Добавляли в пробирки по 1,0 мл раствора р-фенилендиамина. Содержимое пробирок перемешивали и инкубировали 1 час при температуре 37?С. Затем во все пробирки, за исключением контрольной, доливали по 1,0 мл раствора гидроксиламина солянокислого и охлаждали под проточной водой. Измеряли ОП на КФК-3 опытной пробы при длине волны 530-540 нм в кювете с шириной слоя 10 мм против контроля в течение 10 мин. При умножении величины ОП на коэффициент 875 рассчитывают концентрацию церулоплазмина в мг/л [84, 153].
Концентрацию фибриногена определяли по методу Белицер В.А. и соавт [15] после его свертывания высокоактивным тромбином в смеси с ионами кальция и монойодацетатом (инактивация фактора XIII монойодацетатом, что делает сгусток растворимым в уксусной кислоте и препятствует включению в него других плазменных белков). Концентрацию определяли спектрофометрически на СФ-46, измеряя поглощение при длине волны 280нм и 320 нм [15, 94, 153].
При определении содержания средних молекул применяли метод, основанный на очищении сыворотки крови от белков и высокомолекулярных пептидов при добавлении трихлоруксусной кислоты. Остающиеся в над-садочной жидкости среднемолекулярные пептиды выявляются монохрома-тическим потоком света при длине волны 254 нм.
Реактивы: 1. Раствор ТХУ 160 г/л 2. Нитрат натрия 38 г/л. Используется для получения плазмы в соотношении кровь: нитрат = 9:1.
Ход определения. К 0,2 мл плазмы добавляли 0,2 мл раствора ТХУ и осаждали белки центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. К 0,2 мл супернатанта добавляли 2,8 мл ДВ и измеряли УФ - поглощение на спектрофотометре СФ-46 при 254 нм (Д254) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы. В холостой пробе 0,1 мл исходного раствора ТХУ добавляли к 2,9 мл ДВ [33,83].
Концентрацию общего белка определяли унифицированным методом, основанным на взаимодействии ионов меди в щелочной среде с пептидными связями белков сыворотки крови с образованием комплекса красного цвета (биуретовая реакция), ОП которого при длине волны 540 нм прямопропор-циональна концентрации протеинов в сыворотке крови. Определяли ОП на биохимическом анализаторе "Stat fax" (США) при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см опытной и калибровочной пробы против холостой [83,122,153].
- Киев+380960830922