РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень
Са2+, Mg2+-АТФазу отримували з міометрію свиней. Через 20-30 хв. після забою тварин вирізали матку. Потім чистили її від жиру, видаляли ендометрій, промивали у фізіологічному розчині та зберігали до використання при температурі рідкого азоту.
Препарати міозину та актоміозину для дослідження їх функціональних властивостей виділяли з тканини лівого шлуночка серця бика. Матеріал забирався у здорових дорослих тварин при температурі 0-4 оС і зберігався при -15 оС. Патологоанатомічний матеріал для виділення та дослідження препаратів міозину з серця людини отримували в Інституті кардіології ім. Стражеско АМН України.
2.2. Характеристика використаних реактивів
В роботі використовували такі реактиви: аденозинтрифосфат (АТФ), трис(гідроксиметил)амінометан (трис), етиленглікольдиамінтетраоцтова кислота (ЕГТА), 4, 2-гідроксиетил 1-пиперазинетансульфат (НЕРЕS), решта реактивів вітчизняного виробництва та іноземних виробників класу чистоти не нижче ч.д.а.
Для приготування водних розчинів реактивів та середовищ інкубації використовували бідистильовану та деіонізовану воду.
2.3. Методика виділення Са2+-транспортної АТФази плазматичної мембрани гладеньком'язових клітин
2.3.1. Виділення плазматичних мембран міометрію.
Са2+, Mg2+-АТФаза зв'язана з мембраною, тому для її дослідження на початковому етапі одержували плазматичні мембрани матки свині за методом, який був описаний Кондратюк із співавторами [23]. Готували середовище виділення такого складу: 20 мМ гістидину (або 20 мМ імідазолу), 1 мМ етилендиамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), 0,2% азиду натрію, 1 мМ меркаптоетанолу, 0,1 мМ фенілметансульфонілфториду, рН 7.2.
До 15 г тканини додавали 60 мл середовища виділення з добавками: 560 мг КСl та 64 мг NaHCO3. Потім тканину, яка знаходилась в середовищі виділення з добавками, подрібнювали в гомогенізаторі типу "Політрон" впродовж 10 секунд 5 разів з 1-2 хвилинною перервою при 10 000 об./хв. Далі гомогенат центрифугували 15 хвилин при 6 000 об./хв., збирали надосадову рідину та наносили її на градієнт густини сахарози, що складався з 6 мл 30%-ної та 5 мл 15% сахарози.
30% сахарозу готували на середовищі для виділення з такими добавками: 0,7 М КСl та 2 мМ ЕГТА. Хлорид калію вводили для екстрагування з плазматичної мембрани АТФаз, що інгібуються Са2+. ЕГТА добавляли для видалення ендогенного кальмодуліна. 15% сахарозу готували розведенням 30% в два рази розчином середовища виділення з 0,7 М КСl та 2 мМ ЕГТА.
В прозорих пробірках надосадову рідину нашаровували на градієнт густини сахарози. Потім центрифугували одну годину при 105000 g на бакет-роторі. Зібрані смужки, які містили плазматичні мембрани, розводили середовищем виділення до об'єму 60 мл та центрифугували одну годину при 105 000 g. Осад, який містив плазматичні мембрани, суспендували в 0,75 мл середовища такого складу: 130 мМ КСl, 20 мМ HEPES, 0,5 мМ MgCl2, 0,05 СаСl2, 2 мМ дитіотритеол (ДТТ), рН 7,4. Матеріал заморожували та зберігали в рідкому азоті до очистки Са2+, Mg2+-АТФази, яку починали, коли отримували мембрани з 90 г тканини.
2.3.2. Очищення Са2+, Mg2+-АТФази.
Подальша методика виділення транспортної АТФази полягала в солюбілізації ферменту тритоном Х-100 та очищенні білка за допомогою метода афінної хроматографії на кальмодулін-сефарозі 4В [75].
Дослідження Са2+, Mg2+-АТФази в мембранному препараті ускладнене із-за низької питомої активності ферменту, присутності в мембрані Mg2+-АТФази, яка має більш високу питому активність та інгібується Са2+. Коректні результати по вивченню властивостей Са2+, Mg2+-АТФази плазматичних мембран гладеньком'язових клітин міометрію можна одержати на її очищеному препараті. Тому за допомогою методу афінної хроматографії на кальмодулін-сефарозі виділялась Са2+, Mg2+-АТФаза в очищеному вигляді.
Мембрани розморожували, визначали в них білок за методом Лоурі [70], розводили середовищем виділення до концентрації білка 8 мг/мл. До суспензії додавали рівний об'єм такого розчину: 130 мМ КСl, 20 мМ HEPES, 0,5 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 0,05 мМ CaCl2, 0,8 %-ий тритон Х-100, рН 7.4. Потім розчин 10 хвилин перемішували на холоді та центрифугували одну годину при 105000 g. Далі зібрану надосадову рідину об'єднували з 4 мл кальмодулін-сефарози 4В, яка була зрівноважена 130 мМ КСl, 20 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ СаСl2, 2 мМ ДТТ, 0,5 % азолектіном, 0,4 % тритоном Х-100. Суміш перемішували в склянці на холоді 1 годину. Отриману суспензію переносили в колонку та промивали 50 мл розчину, яким була врівноважена кальмодулін-сефароза. Це проводилось з метою вилучення білків, що не зв'язались з кальмодуліном. Після цього проводили елюцію розчином, що був аналогічний попередньому, але 0,1 CaCl2 мМ був замінений в ньому на 2 мМ ЕГТА. Швидкість елюції складала 1 мл/хв.
В процесі хроматографії збирали фракції по 1,4 мл, визначали в них білок за методом Бредфорда [70]. Для цього готували розчин, який містив 0,01% кумассі блакитного, 4,75 % етанолу, 8,5 % ортофосфорної кислоти. До 0,1 мл білка додавали 1 мл розчину кумассі блакитного та через 3-5 хвилин заміряли оптичну густину розчину на спектрофотометрі СФ-26 на довжині хвилі 595 нм. Кількість білка визначали за калібровочною кривою.
2.3.3. Визначення активності Са2+, Mg2+-АТФази.
Фракцію з найбільшою концентрацією білка використовували як препарат очищеного ферменту для вивчення його каталітичних властивостей. Каталітичну активність Са2+, Mg2+-АТФази вимірювали при 40о С в середовищі (загальний об'єм - 0,2 мл) такого складу: 5 мМ MgСl2, 0,1 мМ СаСl2, 3 мМ АТФ, 150 мМ КСl, 0,1 мМ ЕГТА, 50 мМ трис-НСl, рН 7.5, вміст білка 1,5-3 мкг.
Активність Са2+, Mg2+-АТФази виражали в мкмоль неорганічного фосфату Фн / год. на 1 мг білка. Неорганічний фосфат, що утворився внаслідок АТФазної реакції, визначали за