ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМОГО КОНТИНГЕНТА И МЕТОДОВ ЕГО ОБСЛЕДОВАНИЯ
В основу работы положены данные исследования и лечения животных в отделе экспериментальной хирургии и лабораторной диагностики Института неотложной и восстановительной хирургии АМН Украины с 1999 по 2003г.
Использованные методы моделирования, обследования и лечения собак и крыс соответствуют положению про этику при выполнении экспериментов на животных. Работа выполнялась на 2 видах лабораторных животных: собаках и крысах, после формирования модели сахарного диабета (в опыт брали животных с СД средней тяжести, уровень глюкозы в крови от 8 до 14 ммоль/л) исчезновения токсического эффекта аллоксана (30 сутки).
Крысы были подразделены на 4 группы (по 30 животных в каждой): опытная 1 группа - контроль - нелеченные животные, 2 группа опытная -выполнялась депортализация без формирования сосудистого анастомоза, опытная 3 группа - выполнялась трансплантация культур клеток поджелудочной железы, и 4 группа -выполнялось депортализация поджелудочной железы и трансплантация культур клеток поджелудочной железы. Распределение по полу в каждой группе было поровну. Возраст животных колебался от 12 до 14 месяцев, масса тела 244,23±20,31г.
Собаки были разделены на 3 группы (по 20 животных в каждой): 1 группа - животным на фоне диабета выполняли операцию депортализацию с формированием сосудистого анастомоза по типу бок в бок; 2 группа опытная - выполняли депортализацию кровооттока поджелудочной железы с формированием сосудистого анастомоза по типу конец в бок; 3 группа опытная - выполняли депортализацию поджелудочной железы без формирования сосудистого анастомоза.
Сахарный диабет моделировали путем введения водного раствора аллоксана крысам подкожно в дозе 200мг/кг, собакам - внутривенно в дозе 75 мг/кг, причем последним вводили препарат в течении 5-6 минут, параллельно капельно внутривенно вводя физиологический раствор. Для повышения чувствительности В-клеток к аллоксану все животные предварительно 2 суток голодали (Патент Украины на изобретение 356852А, А61В10\00 от 03.10.2002г., Патент Украины на изобретение 57422А, А61В10\00 от 03.10.2002г.). Раствор аллоксана готовили путем растворения кристаллического субстрата Alloxan Tetrahydrate фирмы Fluka-Sigma (Германия) в стерильной дистиллированной воде. После растворения кристаллов вещества стерильность раствора добивались путем пропускания его через мембрану Millex-GV с фильтром 0,22 ?m фирмы MILLIPORE (Франция) и помещали в стерильные закатанные флаконы. Для уменьшения смертности от гипогликемической комы животным через 2-4 часа (после контроля глюкозы крови) давали пить воду с сахаром (Патент Украины на изобретение 356852А, А61В10\00 от 03.10.2002г.).
Рис.2.1. Трофическая язва голени у крысы с аллоксановым диабетом (срок 30 суток)
Для развития диабета (в 98% случаях) было достаточно однократного введения аллоксана. Первые признаки диабета проявлялись резким увеличением суточного потребления воды (более 120 мл), полифагией, полиурией, гипергликемией, резкой потерей в весе (Табл.2.1), выпадением волосяного покрова. В разные сроки эксперимента развивались трофические язвы голени (Рис.2.1), гангрена с самоампутацией хвоста (Рис.2.2.,2.3). Около 15% животных погибло в результате гипергликемической или гипогликемической комы в разные сроки развития аллоксанового диабета.
Таблица 2.1
Динамика массы тела и потребления животными воды при развитии аллоксанового диабета (M±m)*
группа
Показатель
Интактная (контроль)
1 месяц аллоксанового диабетаМасса тела (г) 244,23±20,31 176±9,6Количество потребляемой воды (мл)
65,63±5,47
133,92±12,11 *= различия между группами при р<0,001
Рис.2.2. Диабетическая гангрена хвоста у крысы через 60 суток после развития диабета.
Рис.2.3. Самоампутация хвоста у крысы в срок 70 суток
Фотовидеодокументирование операций производилось на цветную пленку 200ЕД чувствительности с помощью фотоаппарата Зенит ЕТ (производство "ЛОМО" Санкт-Петербург). Видеосъемку выполняли с помощью цифровой видеокамеры Sony 2400EC (производства Япония) на кассеты BASF 90 с последующим перегоном через контролер IEЕЕ 1394 Fire Wire на компьютер Pentium IV и обработкой видеоматериала стандартным набором программ лицензионного пакета Windows XP Home Editor.
Всем животным проводились общий анализ крови, мочи, АЛТ, АСТ, альфа-амилазу, глюкозу крови, холестерин, триглицериды, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП.
Биохимические исследования проведены в лаборатории фундаментальных исследований ИНВХ АМНУ (зав. лабораторией доц. Гнилорыбов А.М.) и биохимической лаборатории Центральной научно-исследовательской лаборатории ДонГМУ (зав.лаб. Якубенко Е.Д., исследования выполняла с.н.с. Турсунова Ю.Д.).
Для контроля удельного веса, глюкозы мочи использовали Diagnostic test strips фирмы "Lachema" (Чехия). Для исследования использовали свежую, хорошо перемешанную и нецентрифугированную мочу без консервантов, отобранную в чистую посуду. Исследования проводили в течении 4 часов после забора мочи. Тест полоску опускали на 1-2 секунды в исследуемую мочу так, чтобы все зоны были смочены. Приблизительно через 60 секунд сопоставляли окраску зон индикации с соответствующей цветной шкалой. Тест определения удельного веса основан на принципе ионного обмена, который происходит между полиэлектролитом и ионами, присутствующими в моче. Результатом является изменение цвета кислотноосновного индикатора из сине-зеленого окрашивания в моче с низкой концентрацией ионов, через зеленое и желто-зеленое до охрово-желтого окрашивания в моче с повышенной концентрацией ионов. При помощи теста возможно определить удельный вес мочи в диапазоне от 1,000 до 1,030. Определение глюкозы основано на ферментативной (глюкозаоксидаза/пероксидаза) реакции, тест специфичен для глюкозы, другие сахара не взаимодействуют.
Для исследования гормонального статуса кровь забирали в количе