РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ БІОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ
2.1. Судово-цитологічна діагностика статевої належності слини за Y- і Х-хроматином
Під час дослідження речових доказів зі слідами слини (недопалки цигарок, сигарети, заклеєні конверти, посуд, ЖГ та ін.), які знайдені на місті події, на одязі або тілі злочинця чи жертви, у ряді випадків необхідно вирішити питання: кому належить слина - чоловікові чи жінці?
Визначення статевої належності є фрагментом судово-медичної експертизи речових доказів. Спочатку визначають, чи дійсно на досліджуваному предметі-носії, зокрема недопалках цигарок, сигарет, використаних ЖГ міститься слина людини. Потім встановлюють стать людини, від якої могли утворитися сліди слини.
Визначити статеву належність слини можна за умови наявності епітеліальних клітин СОПР, які постійно відшаровуються і разом із слиною потрапляють на різні предмети.
Метод визначення статевої належності слини базується на дослідженні структурного утворення в ядрах епітеліальних клітин - Y - та Х-хроматину (статевого хроматину).
Для діагностики статевої належності об'єктів біологічного походження (в т.ч. слідів слини) з 1969 р. використовують методику, яка базується на виявленні в ядрах клітин Х-хроматину - цитологічної ознаки жіночої статі. Застосування цієї методики ефективно для дослідження об'єктів, які походять від жінки; походження ж об'єктів від осіб чоловічої генетичної статі може бути визначено на підставі відсутності Х-хроматину за умови дослідження мінімум 25 - ти епітеліальних клітин слини.
З відкриттям Y-хроматину - цитогенетичної ознаки чоловічої статі - з'явилась можливість визначати належність об'єктів чоловікові за дуже малою кількістю досліджуваних клітин.
Використані прилади та реактиви:
1. Мікроскоп люмінесцентний серії "Люмам" (лампа ДРШ - 250; фільтри: збуджуючі - ФС - 1,5 або СС - 15,2; замикаючі - ЖС - 18 +ЖЗС - 19; об'єктиви люмінесцентні - х20 і х90; окуляри - х10).
2. Центрифуга 1500 об / хв.
3. Стакани (місткістю 100 мл) 4 шт.
4. Центрифужні пробірки (місткістю 10 мл)
5. Піпетки пастерівські
6. Банки скляні з притертими кришками (місткістю 100 - 150 мл)
7. Предметні скельця
8. Покривні скельця
9. Препарувальні, загострені голки
10. Скальпель
11. Фільтрувальний папір
12. Оцтова кислота (5 - 10% розчини); ізотонічний розчин хлориду натрію
13. Ацетон
14. Спирт етиловий (96о)
15. Ефір
16. Натр їдкий (10% водний розчин)
17. Вода дистильована з рН =7,0, яку готували шляхом додавання до 300 мл дистильованої води пастерівською піпеткою 2 - 3-х крапель 10% натру їдкого. Перевіряли рН за допомогою індикаторного паперу або на рН-метрі. Воду використовували не більше 2-х тижнів, та зберігали в холодильнику.
18. Хлорид натрію
19. Флуорохром - 0,5% водний розчин акрихіну (синоніми: атебрин, квінакрин, мепакрин, квінакриндіхлорид тощо), або 0,005% водний розчин пропіл-акрихін - іприту (ПАІ). Фарбники готували наступним чином: розчиняли 50 мг акрихіну в 100 мл дистильованої води (рН=7,0). Якщо додати у розчин 2 г хлориду натрію, то користуватися фарбою можна тривалий час. Розчин фарби зберігали у побутовому холодильнику. Вміст однієї ампули ПАІ додавали в 100 мл цитратно-фосфатного буферу. Приготування цитратно-фосфатного буферу: в 100 мл дистильованої води додавали 1 г Na2HPO4; 5-10 г лимонної кислоти розчиняли в пеніциліновому флаконі дистильованою водою і додавали краплями в розчин натрієвої солі, щоб довести до рН = 6,6 - 6,8 (за допомогою рН-метра).Нерозведеним пропіл-акрихін-іпритом треба користуватись обережно, уникаючи попадання його на шкіру.
20. Масло імерсійне не флуоресціююче.
21. Мікроскоп МБС-1.
22. Фосфатний буфер рН=6,0 готується так: спочатку роблять вихідні розчини. Розчин "А": 9,078 г однозаміщеного фосфату калію (КН2РО4) розчиняють в 1000 мл дистильованої води. Розчин "В": 11,876 г двозаміщеного фосфату натрію (Na2HPO4·2Н2О) розчиняють в 1000 мл дистильованої води. Щоб отримати буфер з рН=6,0 треба 88,0 мл розчину "А" змішати з 12,0 мл розчину "В".
23. Мікроскоп МБІ-6 (або інші аналогічного типу), об'єктив х90 (масляна імерсія) і окуляр х10.
24. Стандартна фарба Романовського-Гімзи або азур-еозинова суміш. Приготування суміші: спочатку готують основні розчини з азуру-ІІ і розчинного у воді еозину, кожний із розрахунку 1 г на 1000 мл дистильованої води. Ці розчини стійкі і зберігаються у посуді з темного скла багато місяців. Основний розчин азуру-ІІ необхідно до використання витримувати два тижні. Суміш для фарбування препаратів готували безпосередньо перед фарбуванням. Необхідно дотримуватись наступного порядку приготування суміші: до І частини еозину додають 3,5 частини дистильованої води з рН = 7,0 - 7,4, а потім доливають 1,5 частини розчину азуру-ІІ. Обережно покачують посуд, змішують інгредієнти. Суміш повинна мати темно-фіолетовий колір.
25. Масло імерсійне.
Посуд та інструменти повинні бути чистими, предметні та покривні скельця знежирені в суміші 96о етилового спирту з ефіром (1: 1).
Реактиви використовують хімічно чисті (ХЧ) або чисті для аналізу (ЧДА).
Методика дослідження:
1. Приготування препаратів.
Перш ніж розпочати готування препаратів зі слідів слини, ми перевіряли якість фарби і необхідну техніку.
Необхідно висвітлити також питання про те, який метод фарбування з використаних нами є більш доцільним за даних умов. Для фарбування мікропрепаратів ми використовували методику запропоновану Х.-П. Кинцль, В. Гибе, Х. Цитцмани, У. Кинцль (1977) щодо визначення статевої належності слідів слини на недопалках сигарет з малокількісним клітинним матеріалом, тобто, методику двохмоментного визначення жіночої і чоловічої статі під час фарбування того ж самого препарату різними методами на Х- і Y- хроматин. Для цього ми попередньо, послідовно (паралельно фарбуванню ЖГ) фарбували по 2 мазки букального епітелію жінок і чоловіків ( які приймали участь в експериментах) і, переконавшись в чіткому виявленні статевого хроматину, переходили до досліджень слідів слини на
- Киев+380960830922