РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень
Матеріалами досліджень були окремі дерева таких видів: Picea abies L. Karst,
Picea pungens Engelm, Pinus pallasiana D.Don, Pinus sylvestris, які росли на
території Ботанічного саду Дніпропетровського національного університету
(контрольна група) та на ділянці з інтенсивним автотранспортним рухом міста
Дніпропетровськ (досліджувана група), де спостерігалося часткове пошкодження
крони. Відбір проводився на стадії активної вегетації. Вивчалося листя різного
віку (першого, другого та третього років), яке було зібране із середнього ярусу
південно–східної сторони крони. Також для досліджень були взяті водні рослини
Juncus effusus L. та Typha latifolia L., які вирощувались як гідропонічні
культури на середовищі: 50% розчин Хогланда на водопровідній воді у
фіто-лабораторії Цетру вивчення навколишнього середовища (Лейпциг, Німеччина)
за [19].
2.2. Екстракція поверхневих ліпідів та схема досліджень
Екстракцію поверхневих ліпідів проводили за схемою Гусакової [139]. Певну масу
зразка свіжого листя обробляли очищеним і перегнаним киплячим (42 0 С)
хлороформом у співвідношенні 1:2 за об’ємом. Екстракцію проводили протягом 30
сек. тричі. Об’єднані екстракти сушили над безводним Na2SO4 при 20 0 С протягом
2 годин. Екстракт фільтрували, випаровували у потоці азоту і отримували сумарну
фракцію. Зважували. У подальшому працювали згідно нижче приведеної схеми (рис
2.1.)
Сумарні поверхневі ліпіди
Гідроліз
Дериватизація
Інфрачервона спектроскопія
Диференційний
температурний
аналіз
Реекстракція
Колоночна хроматографія
Дериватизація
Жирні кислоти Мінорні компоненти Вуглеводні
Газова хроматографія з Аналіз стабільних ізотопів Карбону
мас-спектрометричною
детекцією
Рис. 2.1.Схема досліджень.
2.3 Диференційний температурний аналіз (ДТА)
ДТА зразків проводили на дериватографі системи Паулік-Паулік- Ердей [142] марки
Q-1500 D (MOM) у динамічному режимі в умовах звичайного теплообміну в інтервалі
температур 10-5000С зі швидкістю нагрівання 10 0 С / хв, еталон – Al2O3. при
масі зразків 0,1 г і реєстрації кривих диференційного температурного аналізу з
максимальною чутливістю.
2.4 Гідроліз сумарних ПЛ та реекстракція
Гідроліз сумарних ПЛ, реекстракція та отримання двох ліпідних фракцій –
неомилюючих речовин та жирних кислот проводили за [143]. У круглодонну колбу
піпеткою вносили аліквотну частину розчину, яка містить 15-30 мг ліпідів.
Розчинник видаляли в потоці азоту, до залишку негайно добавляли 5,0 мл
метанольного розчину Na(OH). Суміш кип’ятили протягом 2 годин із зворотнім
холодильником, охолоджували і додавали 5,0 мл розчину NaOH. Вимірювали pH, яка
повинна бути лужною. Вміст колби переливали у ділильну воронку і екстрагували
петролейним етером (Т. кип 30 0 С – 60 0 С) тричі порціями по 5,0 мл. Верхню
легку фракцію відділяли та отримували екстракт неомилюючих речовин.
Водно-спиртову, нижню фракцію підкислювали 0,3 мл 6Н HCl до слабо кислого
середовища та екстрагували хлороформом. Шляхом відділення важкої хлороформної
фракції отримували екстракт жирних кислот. Екстракти сушили добу над безводним
сірчанокислим натрієм. Перед аналізом безпосередньо випаровували екстракт у
потоці азоту і використовували миттєво для дериватизації.
2.5 Дериватизація карбоксильних груп жирних кислот, дитерпенових кислот та
фенольних кислот
Отримання метилових естерів жирних кислот, дитерпенових кислот та фенольних
кислот проводили за [144]. До 30 mg сухого екстракту ПЛ додавали 400 мl гексану
та 50 мl метилюючого реагенту - триметилхлорсилану (Supelco). Отриманий розчин
перемішували, переносили в спеціальні пляшечки із герметичним закорковуванням
(посуд для дериватизації ГРХ, Sigma Chemicals), залишали на 2 год. у термостаті
при температурі 60 0 С. Метилові естери, які утворювалися в цих умовах з псих
сполук, що містили карбоксильну групу (жирні кислоти, кислоти терпеноїдної
природи) висушували у потоці азоту, негайно розчиняли у невеликій порції
метилюючого реагенту і концентрований таким чином розчин наносили на
хроматографічну колонку.
2.6 Розподіл компонентів поверхневих ліпідів на окремі групи методом колоночної
хроматографії
Попередньо метильовані компоненти ПЛ розподіляли методом колоночної
хроматографії на силікагелі G 60 [105], який був активований протягом 3 год. у
муфельній печі при температурі 200 0 С. Розподілення проводили в скляних
мікро-колонках, які заповнювали 1 мл силікагелю. Після нанесення зразку
послідовно проводили промивання колонки чотирьохкратними об’ємами колонки (4
мл) такими розчинниками: гексан – отримували фракцію вуглеводнів; дихлорметан –
відкидали; етилацетат – отримували фракцію вільних жирних кислот, фенольних
кислот, терпеноїдів у вигляді метилових естерів. Також у фракції полярних
компонентів входив сквален, що може бути пояснено значною ненасиченістю
компонента. Після розподілення обидві фракції випаровували та аналізували
методом ГРХ-МС.
2.7 Аналіз метилових естерів жирних кислот методом газо-рідинної хроматографії
з мас - спектрометричною детекцією
Для газової хроматографії з мас - спектрометричною детекцією використовувались
метилові естери жирних кислот. Аналіз проводився на хроматографі НР 6890,
оснащеному мас - спектрометричною приставкою НР 5973 (Hewlett Packard, USA). У
ході роботи використовувалась капілярна колонка (НР/MS 19091S–433, 30 m х 0,25
mm х 0,25 мm, J&W SCIENTIFIC, USA). Газ носій – Не. Початкова температура
камери хроматографа 35єС, яку витримували протягом 2 хв. Потім температура
підвищувалась зі швидкістю 5 є С / хв. до 300 є С і утримувалась протягом 1 хв.
Газова