РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліди проводили на щурах-самцях лінії Вістар вагою 120-150 г., які
знаходилися на стандартному раціоні віварію.
В роботі використані такі реагенти та матеріали: середовище RPMI-1640,
бікарбонат натрію, о-фталевий альдегід, препарат уреази, метиларгінін,
тіопролін, алопуринол, піразол, N-нітрозодиметиламін, канаванін, АТФ (фірма
“Sigma”, США), глутамін, глутамінова кислота, інозин, гіпоксантин, валін,
дексаметазон, аденозин, аргінін, нітросиній тетразолій, трипановий синій (фірма
“Chemapol”, Угорщина), інактивована сироватка (Інститут ветмедицини, Київ),
діетилдитіокарбамат натрію, сульфат заліза, нітропрусид натрію (фірма “Реахим”,
ч.д.а.), нітрогліцерин, пеніцилін, ампіцилін (“Фармацевтична фірма “Дарниця”,
Київ).
Етапи проведення досліджень. Дослідження були проведені в два етапи. На першому
етапі проводили дослідження за умов in vitro на перитоніальних макрофагах
щурів. Сюди входили дослідження по розробці методу активації перитоніальних
макрофагів за умов in vivo, визначення особливостей динаміки загибелі
макрофагів. Вивчали роль цитохрому Р-450 в процесі загибелі макрофагів при дії
N-нітрозодиметиламіну. Вивчали вплив метаболітів пуринового та енергетичного
обміну на синтез оксиду азоту макрофагами; динаміку змін утворення оксиду
азоту, іонів амонію, сечовини в процесі загибелі макрофагів при дії НДМА.
Другий етап досліджень проводили за умов in vivo, де об’єктами досліджень були
печінка, кров, сеча, суцільна тушка, перитоніальні макрофаги щурів. Вивчали
вплив екзогенних нітрозуючих факторів на утворення N-нітрозодиметиламіну з
амідопірину в організмі щурів.
2.1. Виділення та культивування перитоніальних макрофагів
Активовані перитоніальні клітини отримували через 5 - 10 діб після ін’єкції
щурам живої послабленої вакцини БЦЖ ( 1 мг на 100 г маси тіла).
Щурів декапітували під ефірним наркозом. Перитоніальні клітини отримували в
стерильних умовах, промиваючи черевну порожнину середовищем RPMI 1640 (рН
7.25). Клітини перитоніального ексудату промивали 1 раз середовищем RPMI 1640,
центрифугували протягом 5 хвилин при 200 g. Клітини в осаді ресуспендували у
середовищі RPMI 1640 до кінцевої концентрації - 107 на 1 мл. Суспензію клітин
перитоніального ексудату переносили в чашку Петрі (d=40 мм). Інкубували в
термостаті при 370 С протягом 1.5 години. За цей час макрофаги адгезувалися на
пластиковій поверхні чашки Петрі. Обережно зливали рідину з неадгезованими
клітинами. Макрофаги ретельно ресуспендували у середовищі RPMI 1640. Кількість
клітин підраховували в камері Горяєва [133].
2.2. Тест відновлення тетразолія нітросинього
Принцип методу полягає в тому, що при активації фагоцитуючих клітин
відбувається відновлення розчиненого безкольорового тетразолію нітросинього в
диформазан, який розподіляється в цитоплазмі чи на поверхні фагоцитів у вигляді
гранул, забарвлених в темно-синій колір. Цей тест відображає ступінь активації
кисень-залежних механізмів бактерицидної активності фагоцитуючих клітин, в
основі яких лежить активація НАДФН2-оксидази і гексозомонофосфатного шунта.
Електрони, вивільнені з НАДФН2 перетворюють молекулярний кисень в супероксидний
аніон О2, що відновлює тетразолій.
В культуру макрофагів вносили розчин тетразолію нітросинього. Культивували у
вологій камері (37 0С) протягом 22 годин. Після культивування та екстрагування
диформазана диметилсульфоксидом в спектрофотометрі при 492 нм вимірюють оптичну
густину розчину, величина якої відображає метаболічну активність макрофагів
[134].
2.3. Визначення нітритів
Принцип методу. Метод базується на визначенні утвореного забарвленого комплексу
нітрит-іону з реактивом Грісу.
Згідно методу до 0.2мл досліджуваного розчину вносили по 0.02 мл 6.5 N соляної
кислоти, 37.5 ммоль/л сульфанілової кислоти, а через 3 хв. 0.02 мл 0.1%
N-1-нафтилетилендіамінхлориду. Через 40 хвилин проводять вимірювання на
фотометрі Яхонт-01 при 543 нм. Чутливість цієї модифікації наближається до
визначення 1 нмолю нітриту натрію [135]. Кількість нітрит-іону визначали за
калібрувальним графіком, виражали в нмолях на 107 клітин.
2.4. Визначення хемілюмінісценції перитоніальних макрофагів
Світлосуму хемілюмінесценції клітин перитоніального ексудату визначали на
біохемолюмінометрі БХЛ-06 за 30 сек. В полістиролові кювети завчасно вносили по
0.5 мл розчину Хенкса, а потім по 0.5 мл суспензії перитоніальних клітин.
Отриману суспензію в об'ємі 1 мл вміщували у термостат і інкубували 30 хв. при
37 0С. Реєстрували інтенсивність спонтанного (власного) випромінювання, потім
вносили 0.02 мл 1.4х10-5 М розчину FeSO4х7H2O і реєстрували індуковане
випромінювання. Світлосуму індукованої хемілюмінесценції визначалася як різниця
між загальною і фоновою світлосумою хемілюмінесценції.
2.5. Флуоресцентний метод визначення вмісту сечовини
Принцип методу. Метод базується на здатності іонів амонію, що утворилися в ході
ферментативної реакції сечовини з уреазою, формувати стійкі флуоресцентні
комплекси з фталевим альдегідом.
До 10 мкл надосадової культуральної рідини макрофагів додали 100 мкл буферного
розчину уреази. Інкубували протягом 15-45 хвилин при кімнатній температурі.
Додали 3 мл реагенту (склад реагенту: 750 мМ розчин о-фталевого альдегіду в
абсолютному етанолі, 72 мМ розчин b-меркаптоетанолу в етанолі і 0.2 М фосфатний
буфер (рН 7.4) у співвідношенні 1:1:18). Перемішували, при кімнатній
температурі інкубували 30 хвилин до утворення продукту, що є стабільним
флуорофором. Вимір флуоресценції проводили при 405 нм при збудженні 455 нм
[136]. Кількість сечовини визначали за калібрувальним графіком та виражали в
мкмолях іонів амонію на 1
- Київ+380960830922