РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт і матеріали досліджень
Робота виконана в лабораторії клітинної інженерії Інституту біології тварин УААН. Об'єктом досліджень були ооцит-кумулюсні комплекси, одержані з яєчників клінічно здорових телиць і корів чорно-рябої породи, забитих на Львівському та Пустомитівському м'ясокомбінатах. Отримані після забою тварин яєчники промивали фізіологічним розчином NaCl і транспортували в лабораторію у термосі при температурі +30-36?С у фізіологічному розчині (0,9 % NaCl), до якого додавали антибіотики (100 од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину). Яєчники оцінювали за кількістю жовтих тіл і фолікулів та ступенем їх розвитку.
Ооцити з яєчників одержували в лабораторії у боксі при температурі 25-30?С у стерильних умовах, які підтримували за допомогою ультрафіолетового опромінення лампою БУФ-30. Ооцити з яєчників одержували шляхом відсмоктування фолікулярної рідини шприцом з антральних фолікулів діаметром 2-8 мм з подальшим їх вимиванням в середовищі ТСМ-199, що містило гепарин в концентрації 1 од/мл "Biochemi". Після багаторазового промивання в середовищі ооцити оцінювали під фазово-контрастним мікроскопом і за морфологічними ознаками визначали їх придатність для культивування.
Стан ооцит-кумулюсних комплексів визначали під контролем мікроскопу МБС-9 шляхом оцінки кількісного і якісного стану клітин кумулюсу та ооплазми ооцита. Для культивування відбирали ооцити з рівномірно гранульованою ооплазмою, оточені щільним, компактним кумулюсом.
Відібрані після морфологічної оцінки ооцит-кумулюсні комплекси три рази промивали в середовищі ТСМ-199 з додаванням 1%-ї естральної сироватки і 20-30 од/мл гепарину "Biochemi". Для культивування відбирали ооцити круглої форми з гомогенною ооплазмою, щільно та рівномірно в декілька шарів прилягаючими фолікулярними клітинами. Ооцити з порушеною вітеліновою мембраною, вакуолізованою ооплазмою і без фолікулярних клітин в дослідженнях не використовували.
В одноразові мікрочашки переносили 5 ооцит-кумулюсних комплексів, до яких додавали 200 мкл культурального середовища, що складалося з середовища ТСМ-199 або ДМ-335 ("Gibco", Англія) 20% від об'єму середовища попередньо інактивованої естральної або фетальної сироватки, фолікулостимулюючого гормону ("Sigma", 0,012 мг/мл), пеніциліну (80 мкг/мл) і стрептоміцину (50 мкг/мл), пірувату натрію ("Sigma", 0,87 мг/мл) і лактату кальцію ("Sigma", 120 мкл/мл) та досліджуваних компонентів, залежно від варіанту досліду. Для стабілізації рН середовища (рН=7,2-7,4) використовували бікарбонат та HEPES. Готове культуральне середовище ставили на 2 години в термостат для стабілізації при температурі 38,5?С. Культивували ооцити протягом 24-х годин в краплі культурального середовища під шаром парафінового масла в термостаті при температурі 38?С в атмосфері повітря, що містило 5-7% СО2. Мікрочашки поміщали в ексікатор, в піддон якого наливали дистильовану воду для підтримання високої вологості повітря.
2.2. Морфологічна оцінка ооцит-кумулюсних комплексів до і після культивування in vitro
До і після 24-х годин культивування оцінку якості ооцитів проводили візуально за допомогою мікроскопа МБС-9. За морфологічними ознаками ооцит-кумулюсні комплекси поділяли на 5 категорій.
До 1-ї категорії відносили ооцити з однорідним, світлим, компактним, багатошаровим, щільноприлягаючим до ооцита кумулюсом. Ооплазма однорідна, тонкогранульована, дрібнозерниста, рівномірно заповнює прозору оболонку. Гранульозні клітини мають форму кола, щільноупаковані, з рівною і чіткою межею яйценосного пагорбка. Прозора оболонка опалесцентна, рівномірна за шириною, округлої форми. Всі ооцити світлі, прозорі, кулеподібної форми.
До 2-ї категорії відносили ооцити з менш компактним, дещо розпушеним кумулюсом. Внутрішньоклітинна маса ооцита забарвлена рівномірно. Ооплазма гомогенна, однорідна, зерниста, але з дещо темнішою зоною ооцита на периферії. Гранульозні клітини з різним ступенем розрідження, чітка межа яйценосного пагорбка відсутня. Ооцити темніші, менш прозорі.
До 3-ї категорії відносили ооцити з редукованою кумулюсною масою. Кумулюс неоднорідний, досить розрихлений, з частковим відслоєнням від ооцита. Шар клітин гранульози із слідами дегенерації у вигляді темних включень. Ооплазма неоднорідна, з темними включеннями. Має ділянки гранулярної конденсації, ексцентрично заповнює прозору оболонку, гранульована, часто крупногранульована. Прозора оболонка деформована, інколи з ознаками вакуолізації.
До 4-ї категорії відносили ооцити в яких кумулюс у вигляді розрихлених ділянок, які його оточують, слизуватий. Ооплазма дегенерована (зморщена, фрагментована, вакуолізована). Прозора оболонка нерівномірної товщини.
До 5-ї категорії відносили ооцити в яких кумулюсні і гранульозні клітини відсутні або одиночні. Ооплазма з темними включеннями та ознаками дегенерації. Прозора оболонка надірвана чи розірвана. Внутрішньоклітинна маса рівномірно забарвлена темними включеннями. Всі ооцити темні, неправильної форми.
2.3. Удосконалення культурального середовища для дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів in vitro при додаванні біологічно активних речовин
Велике значення для удосконалення культурального середовища має збагачення їх компонентами, які зменшують дегенерацію статевих клітин і покращують дозрівання ооцитів.
Вивчався вплив естрофану F2? та амніотичної рідини на дозрівання ОКК та їх здатність стимулювати процеси ядерного дозрівання ооцитів.
Таблиця 2.1
Схема досліду з культивування ОКК in vitro з естрофаном
ГрупаСклад середовищаКонтрольнаОС: ДМ-335+20% ФСТ+12мкг/мл ФСГ+0,87 мг/мл пірувату натрію+120 мкг/мл лактату кальцію+антибіотикиДосліднаОС+0,5 мкг/мл естрофану
Таблиця 2.2
Схема досліду з культивування ОКК in vitro з амніотичною рідиною
ГрупаСклад середовищаКонтрольнаОС: ДМ-335+20% ФСТ+12мкг/мл ФСГ