РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика об’єкту дослідження
Досліди проводили на білих безпородних щурах з масою тіла 150-180 г, яких
утримували в стандартних умовах віварію. У дослідженнях використано 144
тварини, яких розподіляли на 6 груп.
Перша ? інтактні тварини (контроль).
Друга – тварини, яких впродовж 30-ти діб опромінювали у дозі 1 сГр на апараті
РУМ-17 з використанням фільтрів Cu (0,5 мм) та Al (1 мм); потужність дози –
0,042 мГр•с-1; напруга 140 кВ, сила струму 4 мА, шкірно-фокусна відстань 178
см. Дозу опромінення контролювали клінічним дозиметром типу 27012 (Otto Shon,
Німеччина). Для експерименту використовували тварин на 10-, 20-, 30-ту доби
експерименту, з огляду на те, що за умов хронічного опромінення у дозі 1 сГр
(сумарна поглинута доза становить 10, 20 та 30 сГр) виявлено найбільш виражені
зміни у системі кровотворення та функціонуванні окремих ланок енергетичного
обміну у клітинах кісткового мозку та кишково-шлункового тракту щурів [23, 36,
37, 85].
Третя – тварини, яких використовували для досліджень на 40-у, 50-ту та 60-ту
доби експерименту, після припинення 30 - добового опромінення.
Четверта – тваринам перорально вводили розчинений на оливковій олії
довголанцюговий фармакопейний б-токоферолацетат (б-ТФА), у дозі 47 мг/кг маси
тіла тварин один раз за три дні впродовж 30 - добового опромінення.
П’ята – контрольні тварини, яким per os вводили розчинений на оливковій олії
фармакопейний б-ТФА у дозі 47 мг/кг маси тіла тварин раз за три дні впродовж 30
- добового експерименту.
Шоста – тварини, яким перорально вводили розчинене на оливковій олії
коротколанцюгове похідне б-ТФА, з довжиною бічного ланцюга у 6 атомів вуглецю –
б-ТФАС6, у еквімолярній кількості до фармакопейного препарату – 33 мг/кг маси
тіла тварин раз у три дні впродовж 30 - добового опромінення.
Дози та схеми застосування досліджуваних препаратів визначали на підставі
літературних даних [7, 68, 98].
Евтаназію тварин проводили під ефірним наркозом. Для досліджень використовували
ентероцити тонкого кишківника та клітини гранулоцитарно-моноцитарного та
еритроїдного рядів кісткового мозку.
2.2. Виділення інтактних ентероцитів зі слизової оболонки тонкого кишківника
щурів
Виділення інтактних ентероцитів зі слизової оболонки тонкого кишківника (відділ
дванадцятипалої кишки) проводили за методом Сухомлінова і співавторів [117].
Після декапітації тварин виділяли тонкий кишківник і багатократно промивали
його охолодженим фізіологічним розчином. Слизову тонкого кишківника відділяли
від м’язово-серозного шару (на холоду). Наважку слизової 200-250 мг поміщували
в ізотонічний розчин Кребса (рН 7,9) такого складу: NaCl - 7,054 г; KCl – 0,439
г; NaHCO3 - 1,275 г; NaH2PO4 - 0,144 г; C6H12O6 - 2,07 г; CaCl2 (безв.) - 0,277
г; MgCl2 (безв.) - 0,133 г – в 1 л дистильованої води.
Трипсинізацію слизової проводили 0,03% розчином трипсину фірми “Spofa” у
вищевказаному розчині при температурі 37єС впродовж 15 хв (вміст бюкса постійно
перемішувався на магнітній мішалці). Після інкубації суспензію переносили у
конічні центрифужні пробірки, зупиняючи реакцію трипсинізації додаванням
охолодженого розчину Кребса. Суспензію центрифугували при 3000 об/хв впродовж 3
хв. Надосадову рідину зливали, а до осаду додавали двократний об'єм розчину
Кребса. Центрифугування повторювали 3 рази для видалення трипсину.
Дана методика отримання інтактних ентероцитів зі слизової оболонки тонкого
кишківника забезпечує збереження основних морфологічних і функціональних
характеристик цих клітин [125].
Клітини ентероцитів руйнували шляхом заморожування у рідкому азоті (t = -
183єС), двічі повторюючи процедуру. Екстракцію білків проводили при 0 -4єС у
трис-сахарозному буфері (0,25 М сахароза, 0,025 М KCl, 0,003 М MgCl2 і 0,05 М
трис-буфер (рН 7,4) впродовж години. Співвідношення маса : об’єм –1:5. Екстракт
відділяли центрифугуванням впродовж 30 хв при 7500 g. Надосадову рідину
використовували для подальших досліджень.
2.3. Виділення кісткового мозку щурів
Кістковий мозок отримували методом аспіраційної біопсії. Для цього відрізали
епіфізи з великих стегнових кісток лабораторних щурів і промивали фізіологічним
розчином за допомогою шприца. Тяжі кісткового мозку подрібнювали багатократним
пропусканням через голку шприца. Суспензію кісткового мозку фільтрували через
чотири шари нейлонової тканини. Отриману таким чином суспензію
кістково-мозкових клітин тричі промивали фізіологічним розчином при 600 g
впродовж 5 хв. Відмиті клітини фракціонували у градієнті густини
фікол-верографіну.
2.3.1 Фракціонування клітин кісткового мозку у градієнті густини сумішей фіколу
і верографіну. Принцип методу полягає у розділенні клітин кісткового мозку у
тришаровому градієнті густини суміші фіколу та верографіну (с1 = 1,03 г·см-3;
с2 = 1,09 г·см-3; с3 = 1,1 г·см-3).
За допомогою цього методичного прийому вдається відразу отримати три клітинні
фракції. Перша фракція включає клітини лімфоїдного ряду, друга – клітини
еритроїдного ряду, а третя складається з клітин різного ступеня зрілості білого
паростку кровотворення [111].
Реактиви і обладнання:
0,85% розчин хлориду натрію, приготований на основі фосфатного буферу (рН =
7,2);
9% розчин фіколу (Ficoll-400, “Pharmacia”, Швеція) готували на основі
забуференого фізіологічного розчину (перший розчин), до якого додавали хлорид
кальцію до концентрації 1% і хлорид магнію – 1% (с1=1,03г·см-3);
розчин сумішей фіколу з верографіном (Verografin “Spofa” Чехія) готували таким
чином:
а) 59 мл 8% фіколу змішували з 11 мл 60 % верографіну (с2=1,09 г·см-3);
б) 50 мл 8% фіколу змішували з 14,5 мл 60 % верографіну (с3=1,1 г·см-3).
Гу
- Київ+380960830922