РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика методов исследования
Под наблюдением находилось 100 больных хроническим гломерулонефритом с различной степенью нарушения функции почек. Обследование проводилось в условиях нефрологического отделения Харьковского областного центра урологии и нефрологии (ХОКЦУН) в период с 2002 по 2003 гг. Лабораторные исследования проводились на базе клинико-иммунологической лаборатории ХОКЦУН.
Диагноз устанавливался на основании тщательного клинического обследования больных: анамнеза, объективных данных, клинических анализов крови и мочи, исследования мочи по Зимницкому, Нечипоренко, определения суточной потери белка с мочой, скорости клубочковой фильтрации, содержания мочевины и креатинина крови, электролитного баланса, ЭКГ, внутривенной урографии, ультразвукового исследования почек.
Для определения уровня общего L-гомоцистеина (Гц) в сыворотке крови за сутки до исследования больной начинал получать пищу со сниженным количеством белков. Через день в 8 ч.30 мин. производился забор крови в пробирку содержащую ЭДТА. Образец цельной крови должен был быть оставлен для образования сгустка не более чем на 30 минут до центрифугирования и отделения сыворотки. Образцы крови рекомендовалось хранить на льду до отделения сыворотки.
Уровень Гц определялся методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы фирмы Axis. Принцип метода состоит в том, что связанный с белком Гц восстанавливается до свободного Гц и превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин (SAH) ферментативным путем в специальной процедуре, предшествующей иммуноанализу. Фермент специфичен для L-формы Гц (единственная форма, в которой Гц присутствует в крови).
Восстановление Гц: смесь дисульфида и белок-связанной формы Гц в образце восстанавливается до свободного Гц при использовании дитиотреитола (DТТ).
Белок-SS-Гц DTT
*R1-SS-Гц Гц, где *R1 - любая тиоловая группа
Гц-SS-Гц
Ферментативная реакция: Гц образца превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин с использованием SAH-гидролазы в присутствии избытка аденозина (Ad).
Гц + Ad SAH + Н2О
Следующий твердофазный иммуноферментный анализ основан на конкуренции между SAH в образце и SAH, иммобилизованным в ячейках планшета за сайты связывания с моноклональными анти-SAH-антителами. После удаления анти-SAH-антител, не связавшихся с планшетом, добавляются вторые кроличьи антимышиные антитела, меченые пероксидазой хрена. Активность пероксидазы измеряется на спектрофотометре после добавления субстрата. Полученная абсорбция обратно пропорциональна концентрации общего Гц в пробе.
Для изучения параметров липидного метаболизма накануне исследования в 19 ч. больной получал легкий ужин без содержания жиров. На следующий день в 8 ч.30 мин. производили забор крови в пробирку содержащую ЭДТА. Плазму отделяли от форменных элементов центрифугированием при 600g. в течение 3 минут и использовали для анализа немедленно или хранили при температуре 4?С, но не более 24 часов. Руководствуясь рекомендациями экспертов ВОЗ для липидных лабораторий, общий холестерин плазмы крови определяли с помощью многоступенчатого метода в модификации L.L. Abel и соавт. [105] в описании В.Г. Колба и В.С. Камышникова [106]. Суть метода заключается в том, что холестерин гидролизуется холестеролоксидазой до холест-4-ензенола, который в присутствии пероксидазы хинониминовым красителем окрашивается в розовый цвет. Концентрация хинонимина прямо пропорциональна концентрации холестерина в пробе и определяется фотометрическим методом. Концентрация триглицеридов (ТГ) плазмы крови определяется по содержанию в них глицерина. Глицерин образуется при гидролизе триглицеридов липазой и в присутствии АТФ и глицерокиназы фосфорелируется превращаясь в глицерил-3-фосфат, который в присутствии пероксидазы хинониминовым красителем окрашивается в розовый цвет. Концентрация хинонимина прямо пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе и определяется фотометрическим методом [107]. Для определения холестерина в составе липопротеидов высокой плотности использовали (ХС ЛВП) стандартный набор реактивов фирмы Olvex Diagnosticum (Россия). Принцип метода заключается в том, что хиломикроны, липопротеиды низкой плотности (ЛНП) и липопротеиды очень низкой плотности (ЛОНП) осаждаются при добавлении к образцу фосфорновольфрамовой кислоты и Mg?+. После центрифугирования в супернатанте остаются только липопротеиды высокой плотности, концентрация которых определяется так же, как и концентрация общего холестерина. Холестерин липопротеидов низкой плотности определяли с помощью уравнения Фридвальда [108]. Использование данной формулы считается уместным при соблюдении трех основных условий [108]:
1. Концентрация триглицеридов в анализируемых образцах должна быть меньше 400 мг/дл (4,66 ммоль/л).
2. В анализируемых образцах должны отсутствовать хиломикроны, т.е. кровь может отбираться только в состоянии натощак.
3. Образцы не должны содержать бета-ЛОНП ("плавающих" бета-липопротеинов, характерных для гиперлипопротеидемии III типа).
Концентрацию ХС ЛНП рассчитывают по формуле Фридвальда следующим образом: ХС ЛНП = ОХС - ХС ЛВП - (триглицериды /5), где все концентрации выражены в мг/дл, а параметр триглицериды /5 отражает концентрацию ХС ЛОНП. Если концентрации выражены в ммоль/л, то уровень ХС ЛОНП рассчитывают как триглицериды /2,22.
Статистическая обработка материала проведена на РС IBM - Pentium II c использованием электронных таблиц Microsoft Excel, адаптированных для медико-биологических исследований С.Н. Лапач и др. [109].
2.2. Клиническая характеристика больных
Обследовано 100 больных хроническим гломерулонефритом с различной степенью нарушения функции почек, из них 39