РАЗДЕЛ 2
Материалы и методы исследований
При проведении экспериментов были использованы следующие методы:
- приготовление первичной диссоциированной культуры изолированных нейронов
тригеминальных ганглиев и спинальных заднекорешковых ганглиев крыс с
использованием ферментативно-механической обработки ганглиев,
- метод внутриклеточного диализа,
- метод фиксации потенциала в конфигурации "целая клетка" на мембране нейронов
спинальных и тригеминальных ганглиев,
- метод прыгающего столика "jumping table",
- анализ экспериментальных данных с использованием статистических методов и
моделей.
2.1. Получение нейронов
Эксперименты проводились на пяти- семидневных крысятах линии Вистар. Животные
содержались в виварии согласно Европейской конвенции о защите животных, которые
используются в экспериментах и других научных целях (Страсбург 18.03.1986г.) и
научно практическим рекомендациям по содержанию лабораторных животных и работы
с ними Министерства здравоохранения Украины (Киев, 2002). Для получения
достоверных данных по запланированным исследованиям было использовано
необходимое минимальное количество животных.
Для получения суспензии нервных клеток из спинальных корешковых и
тригеминальных ганглиев использовалась комбинация из двух методов:
ферментативная обработка и механическая диссоциация.
Для сохранения полученных изолированных нейронов мы использовали питательные
среды, содержащие аминокислоты, солевые растворы, глюкозу и сыворотку. Для
предупреждения бактериальных заражений в эти растворы мы добавляли антибиотики
(стрептомицин 50мкг/мл, пенициллин 50 ед./мл).
2.1.1. Получение нейронов спинальных ганглиев
Животных декапитировали. Спинальные ганглии отделяли от спинного мозга и
помещали в раствор, содержащий минимальную среду Игла (МЕМ, "Sigma", США), 20
мМ HEPES, натриевую соль бензилпенициллина – 50 ед./мл, стрептомицина сульфат –
50 мкг/мл. Затем ганглии подвергались ферментативной обработке 0,2% раствором
протеазы XIV типа ("Serva", США) при 34 оС в течении 30 – 45 минут и
одновременно встряхиванию на магнитной мешалке.
Для ингибирования фермента после ферментативной обработки спинальные ганглии
помещали в холодную среду (5 – 10 оС), состав которой описан выше, и отмывали в
течении 20 минут при встряхивании на магнитной мешалке.
Механическая диссоциация ганглиев проводилась с помощью пастеровских пипеток c
последовательно уменьшающимися диаметрами кончика. Мы использовали пастеровские
пипетки с диаметрами кончика 1 мм, 800 мкм, 600 мкм и 400 мкм.
2.1.2. Получение нейронов из тригеминальных ганглиев
Животных декапитировали. Тригеминальные ганглии подвергались ферментативной
обработке 0,8% раствором трипсина ("Sigma", США) в бес кальциевом растворе при
34 оС в течении 45 минут и одновременно встряхиванию на магнитной мешалке.
Для ингибирования фермента после ферментативной обработки ганглии помещали в
холодный внеклеточный раствор (5 – 10 оС), состав которого описан ниже, и
отмывали в течении 20 минут при встряхивании на магнитной мешалке.
Механическая диссоциация ганглиев проводилась под контролем микроскопа в
растворе с бычьей сывороткой (состав которого описан ниже) и 0,2% соевого
ингибитора, при помощи заточенных игл выделялись клетки. Диаметры полученных
клеток были приблизительно 10-40 мкм.
2.2 Растворы и реактивы
Все реактивы, использованные в работе, имели квалификацию ХЧ или разрешение
для медицинского использования. HEPES, Tris, CdCl2, трипсин, соевый ингибитор
трипсина - фирмы "Sigma"; протеаза, тетродотоксин, теофиллин, кофеин,
кофеин-бензоат - фирмы "Serva"; бромтеофиллин (бротеофин) любезно предоставлен
проф. И.И. Кузьменко, Институт фармакологии и токсикологии (Киев, Украина),
новый анальгетический агент Д57 (производное пиролимидазола) профессором Т.А.
Бухтияровой, Институт фармакологии и токсикологии (Киев, Украина).
Составы применяемых растворов представлены в таблице 2.1.
Все использованные в работе растворы были приготовлены на основе
бидистилированной воды.
pH доводился до 7.4 (для растворов №1 и №3 ) или 7.3 (для раствора №2) путем
добавления Tris-OH.
В состав наружного раствора (№1) добавлялся также тетродотоксин (ТТХ, "Sigma"
США) в концентрациях указанных в тексте.
Раствор с бычьей сывороткой: 25 мл сыворотки в 100 мл внеклеточного раствора
(№1).
Исследуемые вещества добавлялись к омывающему (внеклеточному) раствору №1 или к
раствору №2, при внутриклеточной перфузии, в концентрациях, указанных в тексте.
Опыты проводились при комнатной температуре (20-250).
Таблица 2.1
Состав растворов использованных в работе (мМ/л)
Соли
Внеклеточный
раствор (рН-7.4)
№1
Внутриклеточный
раствор (рН-7.3)
№2
Раствор без Са2+
(рН-7.4)
№3
NaCl
152
10
152
KCl
3.7
76
3.7
CaCl2
2.6
MgCl2
1.1
1.1
1.1
TrisCl
10
10
10
KF
76
CdCl2*
0,1
Глюкоза
10
*добавляли к раствору для блокирования Са – тока
Быстрая замена наружных растворов производилась при помощи "прыгающего
столика".
2.3. Регистрация данных и обработка результатов.
Наиболее эффективными методами исследования ионных механизмов, лежащих в
основе электровозбудимости нервных клеток являются методы внутриклеточного
диализа и фиксации потенциала.
Методы позволяют контролировать и произвольно изменять на мембране
изолированных клеток концентрационные градиенты любых ионов, прикладывать
биологически активные вещества к обеим сторонам мембраны и измерять
трансмембранные токи в условиях фиксации потенциала.
Разделение ионных токов проводилось путем изменения ионного состава вне- и
внутриклеточного растворов и применения веществ, специфически блокирующих
определенные
- Киев+380960830922