РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.
2.1. Експериментальні та клінічні методи досліджень направлених на
обґрунтування доцільності місцевого застосування натрію гіпохлориту на етапі
хірургічного лікування раку молочної.
Для обґрунтування місцевого застосування НГ для обробки післяопераційної рани
на етапі хірургічного лікування раку молочної залози, нами було виконано ряд
експериментальних та клінічних досліджень. Характеристика об’єктів та методів
досліджень наведена в таблиці 2.4.
Таблиця 2.4
Об’єкти та методики дослідження
Назва фрагменту роботи
Кількість
об’єктів
Застосована методика
1.
Визначення цитотоксичної, антипроліферативної і антиадгезивної дії ГН на
культуру клітин.
9 культур злоякісних клітин
Мікробіологічні, цитологічні дослідження впливу ГН на культури клітин
2.
Визначення проценту та тривалості післяопераційних ускладнень хірургічного
лікування хворих на РМЗ
148 хворих основної і 202 хворих контрольної груп.
Статистичні дослідження частоти післяопераційних ускладнень в групах хворих.
3.
Дослідження змін в параклінічних показниках після застосування ГН на етапі
хірургічного лікування хворих на РМЗ
148 хворих основної і 202 хворих експеримент-тальної груп.
Визначення змін в лабораторно-клінічних показниках.
4.
Визначення змін в показниках системного імунітету після застосування ГН на
етапі хірургічного лікування хворих на РМЗ
30 хворих основної і 60 хворих контрольної груп.
Визначення змін в показниках системного імунітету.
5.
Дослідження впливу місцевого застосування ГН на віддалені результати
хірургічного лікування хворих на РМЗ
148 хворих основної і 202 хворих контрольної груп.
Використано статистичне дослідження безрецидивної та загальної виживаності
хворих на РМЗ .
2.2. Методика вивчення протипухлинної активності НГ in vitro.
В роботі використовували наступні культури злоякісних клітин:
МКС-ТМ – клітинна лінія, отримана з метастазу спонтанного раку молочної залози
щура.
МАК-3 клон С7 – високо злоякісна лінія клітин раку молочної залози миші
(похідна лінія отримана з раку Ерліха).
МЗС – первинна культура клітин спонтанного раку молочної залози собаки (
використана на перших пасажах після посадки в культуру ).
MCF – культура раку молочної залози людини.
Нер-2 – лінія клітин карциноми гортані людини.
Нер-A1st i Hep-B5st – клони Нер-2, трансформовані регуляторним геном Таt вірусу
імунодефіциту людини (ВІЛ).
ММ-4 – лінія клітин меланоми миші.
ММ-М2 – високо метастатична сублінія клітин меланоми, яка отримана шляхом
двократних внутрішньовенних пасажів клітин ММ-4 з наступним рекультивуванням
метастазів in vitro.
ЛСК – суспензійна клітинна лінія, отримана з лімфосаркоми щура.
Всі клітини одержані з Клітинного Банку Інституту експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.
Всі клітини культивували на середовищі RPMI-1640 („Sigma”, St.Louis, MO, USA),
що містить 2мМ L-глютаміну, 10% ембріональної яловичої сироватки
(„Діагностикум”, Львів, Україна ) та 50 мкг/мл гентаміцину („Sigma”, St.Louis,
MO, USA ), при 370С в зволоженій атмосфері, що складалась з 5% вуглекислого
газу та 95% повітря. Клітини культивували в пластиковому посуді фірм „Falcon” i
„Flow Lab” ( USA).
В роботі використовували офіцинальні розчини НГ з похідною концентрацією 0,86
г/л. Препарат використовували протягом 2-3 діб після приготування.
Рекомбінантний препарат a2-інтерферону людини (пит. акт. 108 МЕ/мг)
використовували у вигляді комерційного препарату „Лаферон (ІМБГ, Київ,
Україна), рекомбінантний препарат фактору некрозу пухлини людини (пит. акт.
2х107Од/мг) був люб’язно наданий В.Г.Коробко (ІБОХ Москва, Росія), актиноміцин
D було придбано у фірми ”Sigma” (St. Louis, MO, USA).
Для оцінки цитотоксичної активності НГ, 105 клітин в 0,1 мл ростового
середовища розташовували в лунки 96-луночної планшети. До суспензії клітин
додавали розчини препарату, приготовані в ростовому середовищі, в об’ємі 0,1
мл. Планшети інкубували протягом 1 або 18 годин при температурі 370С, потім в
кожну лунку додавали 20мкл 0,3% розчину трипанового синього і виявляли
процентне співвідношення живих та мертвих клітин з допомогою гемоцитометра.
Антипроліферативну активність НГ оцінювали за допомогою декількох методик:
Клітини моношарових ліній (2-3х105 клітин) вносили в гнізда 24-луночних планшет
в об’ємі 1 мл. Через 24 години середовище видаляли, на моношар клітин наносили
розчини НГ в ростовому середовищі на 1 або 18 годин при 370С, після чого
клітини відмивали двічі від препарату ростовим середовищем та додатково
інкубували 24-48 г. у ростовому середовищі. Після обробки середовище з лунок
видаляли і вносили 1мл версену для відшарування клітин від субстрату, фарбували
трипановим синім і підраховували кількість живих і мертвих клітин. Для кожної
точки використовували 2-3 паралельні лунки. Морфологічні зміни клітин в
культурах контролювали відразу після початку обробки і протягом всього
експерименту візуально з допомогою інвертованого мікроскопу (K. Zeizz,
Німеччина).
Клітини суспензійної лінії ЛСК обробляли НГ в суспензії (106/мл), додаючи
рівний об’єм відповідного розведення препарату, через 1 годину двічі відмивали
ростовим середовищем з допомогою центрифугування і розміщували в 24-луночну
планшету з щільністю 2х105/мл на лунку. Концентрацію клітин для аналізу їх
росту визначали щоденно в кожній лунці протягом 5-10 діб в залежності від умов
експерименту.
Клітини ЛСК (3х105/мл) культивували тривалий час в присутності мінімальної дози
НГ (0,043 мг/мл) нетоксичної для клітин протягом, як мінімум, 18 годин. Після
досягнення клітинами відносно високої щільності (6х105/мл), їх ві
- Киев+380960830922