РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали
2.1.1. Штами Esherichia сoli та Agrobacterium tumefaciens .
Бактеріальний штам Esherichia coli для клонування ДНК: TG-1 (Д(lac, pro), thi,
strA,sup E, ENDa,SBSb,HSDr, Ftra D36, proAB, lac lg, zДM15) отримано від
Т.Джилсона (Кембриджський університет, США);
Штами Agrobacterium tumefaciens: PGV 3850 (С58С1); LBA 4404.
2.1.2. Вектори для клонування.
рКС7, pML2d, pBlueskript(+), pUC19 (“Stratagene” США).
Для трансформації Agrobacterium tumefaciens використовували бінарний вектор
pBin19.
2.1.3. Рослинний матеріал.
Вихідні рослини тютюну Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SRI були введені в
культуру стерилізацією насіння і підтримувались субкультивуванням пагонів на
живильному середовищі MS [196].
2.1.4. Живильні середовища.
LB середовище (Луріа-Бертрані): бактотриптон-1% (Difco), бакто-дріжджовий
екстракт-0,5% (Difco), NaCl - 1% (Sigma), рН 7,5;
LB агар: до 1 л середовища LB додавали 15г бакто-агару (Difco);
2ЧYT: бактотриптон 1,6% (Difco), дріжджовий екстракт-1% (Difco), NaCl-0,5%
(Sigma) на 1 л води, рН 7,0;
MSD: середовище MS [196], БАП – 1,0 мг/л, НУК-0,1 мг/л;
MSD4Ч2: солі MS [196] з наступними добавками: НУК 0,1 мг/л, БАП 1,0 мг/л
цукроза 30000,0 мг/л, рН 5,8.
Для проведення селекції бактеріальних клонів по кольору в тверде середовище
додавали 2мМ IPTG та 350 мкг/ мл X-gal (Boehringer Mannheim GmbH),
приготовлений у 100%-ному N,N-диметилформаміді.
Автоклавування всіх середовищ проводилось при 1 атмосфері на протязі 20 хв.
2.1.5. Антибіотики.
Антибіотики, що використовувались для селекції рекомбінантних клонів:
Ампіцилін (Ар) 35-50 мг/л, канаміцин (Km) 50 мг/л, хлорамфенікол (Cm) 90 мг/л.
2.1.6. Буфери та розчини.
ТЕ - Трис-HСl 10мМ, ЕДТА 1 мМ, рН 7,6;
ТВЕ – 45мМ тріс-борат, 1 мМ ЕДТА, рН 8,0;
20 Ч SSC буфер – NaCl 3M, Na2 цитратЧ2Н2О 0,3М, рН 7 (доводити HCl);
20 Ч SSPE - NaCl 3M, NaH2PO4 Ч H2O 0,2M, ЕДТА-Na2 0,02 M pH 7,4 (доводити 10Н
NaOH);
10 Ч лігазний буфер для Т4 ДНК лігази – Тріс 0,5 М рН7,4, MgCl2 – 0,1М, DTT –
0,2M, АТФ – 10мМ, БСА-50мг/мл;
тРНК із дріжджів, 10мг/мл.
2.1.7. Ферменти рестрикції та модифікації.
Ферменти рестрикції:
HindIII, EcoRI, Sau3A, BamHI, BglII, AluI, RsaI, SmaI, NarI, EheI, NcoI,
HindIII лінкер “Promega” (США), “Fermentas” Литва.
Буферні системи для реакцій рестрикції використовували ті, що пропонували фірми
- виготовлювачи. Для реакції спільної рестрикції використовували
середньо-сольовий буфер (буфер “С”) або буфер “One-for-All Buffer” “Serva”
(Швеція) 10 Ч концентрації.
Ферменти модифікації:
Великий фрагмент ДНК-полімерази (фрагмент Клєнова), “Serva” (Швеція);
ДНК-лігаза, РНК-лігаза, Т4-полінуклеотидкіназа, РНКаза А “Promega” (США); S1
нуклеаза, Taq-полімереза “Serva” (Швеція), BglII-BamHI адаптор фірми
„Amersham”(UK), набор для сиквенсу “Т7-Сиквенс”, “Fermentas” Литва.
2.1.8. Ізотопи.
[б-32P] dATP, [б-32P] dСTP, [б-32P] dTTP 3000 Ки/ммоль („Amersham”, UK);
[14C]-хлорамфенікол 50-60 Ки/ммоль („Amersham”, UK)
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Рестрикція та лігування плазмідної ДНК.
Гідроліз плазмідної ДНК здійснювали 2Чнадлишком рестрикційних ендонуклеаз у
10-200 мкл рестрикційної суміші. Рестрикцію проводили на протязі 1-2 годин. Для
кожного фермента використовували умови, що пропонували фірми-виготовлювачи
(склад буфера, температура, рН).
Лігування проводили згідно методу [197] за допомогою ДНК-лігази фага Т4.
ДНК-лігазу на кожну пробу брали 0,8-1 од.
2.2.2. Виділення плазмідної ДНК.
50 мл середовища, що містить 100 мкг/мл ампіциліну інокулювали одиничною
колонією й вирощували на мішалці при +370С, 120 об/хв., у конічній колбі
протягом ночі.
Бактеріальні клітини осаджували центрифугуванням у центрифузі К-27 при 3500
об/хв, при +4°С, 20 хв. Зливали супернатант. Осад ресуспендували в 2 мл
попередньо охолодженого розчиниу 1 (50 мМ тріс-НCl рН 8,0; 10мМ ЕДТА) і
інкубували протягом 5 хв. на льоді. До суспензії додавали 2 мл розчину 2 (200
мМ NaOH; 1% SDS), обережно перемішували й інкубували протягом 5 хв. при
кімнатній температурі. Потім додавали 2 мл розчину 3 (3М KCH3COO, p5,5),
обережно перемішували й витримували 5 хв. на льоді. Отриману суміш
центрифугували в К-24 при 8000об/хв., при +4°С, 20 хв. Надосадову рідину
фільтрували й до неї додавали рівний об'єм 13% ПЕГа. Витримували на льоді
протягом 1 години. Потім, додавали рівний об'єм суміші фенол:хлороформ (2:1) і
інтенсивно струшували протягом 2 хв. Потім фази розділяли центрифугуванням при
2500 об/хв. впродовж 5 хв. Верхню фазу видаляли й повторювали екстракцію
сумішшю фенол:хлороформ, а потім також хлороформом без фенолу. До надосадової
рідини додавали 1/10 частини об'єму 3М ацетати натрію й 2,5 об'єми 96% етанолу.
Отриману суміш витримували при -20°С не менш однієї години. Осадження проводили
центрифугуванням у К-24 при 10000 об/хв. Осад промивали 1 мл 75% етанолау,
висушували на повітрі й розчиняли в 1 мл ТЕ-буфера.
Для звільнення від РНК до отриманого препарату додавали РНКазу А до кінцевої
концентрації 1 мкг/мл і інкубували при 37°С, 1годину. РНКазу А видаляли
екстракцією фенол:хлороформ, як описано вище. Отриманий осад розчиняли в
ТЕ-буфері.
2.2.3.Електрофорез препаратів ДНК.
Електрофорез проводили в горизонтальному апараты в агарозному гелі з
використанням тріс-ацетатного й тріс-боратного буферів. Концентрація агарози
(„Sigmа”, США) становила 0,7-1,5 % залежно від довжини фрагментів ДНК [198].
Після електрофорезу гель фарбували в розчині бромистого етидія (0,5мкг/мл). В
якості маркерів
- Киев+380960830922