РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень
При виборі стратегії застосування експериментальних методик виходили з мети та окремих задач, сформульованих в роботі. Оскільки головним предметом досліджень даної роботи є початкові стадії індукції ІФН, потрібно було обрати такі характеристики стану клітин, які визначають швидку реакцію клітини на зміну оточуючого середовища (у нашому випадку - контакт з молекулами індуктору), а також здатність індукувати ІФН.
2.1. Реагенти, матеріали та об'єкти, використані в експериментах
Препарати РНК. У експериментах було використано комерційний препарат дріжджової РНК (рибосомальна фракція) (НПО "Біохімреактив", Олайна, Латвія), на основі якого готували інтерфероногенний молекулярний комплекс (МК). В якості препаратів порівняння використовували ридостин (дволанцюгова РНК дріжджів S. cerevisiae, НПО "Вектор", Росія) та полі(І)-полі(С) ("Serva", Німеччина). Препарат дріжджової РНК додатково очищали потрійною фенольною депротеїнізацією з подальшим осадженням етанолом згідно стандартної методики [Методи исслед. нукл. кислот 1970]. Препарати РНК розчиняли у стерильному фосфатно-сольовому буфері або поживному середовищі 199 до потрібної концентрації перед використанням. При необхідності розчини зберігали при 4 ?С не більше тижня.
Носій для іммобілізації інтерфероногенного молекулярного комплексу. Як нерозчинний гранулярний носій для іммобілізованого інтерфероногенного молекулярного комплексу (ІММК) використано сферон (Spheron 300 (LC) 63-100 ?m "Lachema", Brno, Чехія).
Гідрохлорид тилорону. У якості низькомолекулярного компоненту МК та ІММК використовували препарат тилорону - 2,7-біс[2-(диетиламіно-етокси)-флуорен]-9-он дигідрохлорид ("Sigma", США).
Хімічні реактиви, що використовувались в роботі. В роботі використовували Na-ЕДТА (версен) ("Serva", Німеччина); бромціан ("Sigma", США); трис-(гідроксиметил)амінометан (НПО "Біохімреактив", Олайна, Латвія); орцин ("Sigma", США); 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазиноетансульфонова кислота (HEPES) ("Serva", Німеччина); 95% глютаровий альдегід 20 % водний розчин ("Lachema", Чехія); бромціан ("Sigma",США); ацетонітрил ("Aldrich", Німеччина); "Phicoll-400" Mr = 4?105 Да ("Pharmacia", Швеція); "Trasograph" (діатрізоат меглумін, діатрізоат меглумін натрій) 76% ("Unic pharmaceuticals labs", Індія); пірен 99 % для флуоресцентних досліджень ("Fluka", США); етидій бромід ("Aldrich", Німеччина); аденозинмонофосфат (АМФ) ("Sigma", США); аденозинтрифосфат (АТФ) ("Sigma", США); реактив Фоліна-Чокальтеу ("Sigma", CША), оубаїн ("Sigma", CША), трипановий синій ("Хімлаборреактив", Україна).
Хімічні сполуки, що використовувалися в роботі (Табл. 2.1), за виключенням ряду відмічених випадків, застосовували без додаткової очистки.
Таблиця 2.1.
Хімічні сполуки, що використовувалися в роботі
Найменування
сполукиКваліфікація
чистотиДодаткова
очисткаHCl
КOH
KCl
KH2PO4
NaCl
Na2HPO4?12H2O
Na2CO3?10H2O
NaHCO3
NaN3
Na3VO4
(NH4)2MoO4?2H2O
CaCl2
MgCl2?6H2O
FeCl3?6H2O
Цитрат натрію
Етанол, 96%
Трихлороцтова кислота (ТХО)
Глюкоза
Аскорбінова кислотач.д.а.
х.ч.
ч.
ч.
о.с.ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
ч.д.а.
ч.
ч.
ч.
ч.-
-
висушування
перекристалізація
перегонка
-
Культури клітин. В роботі використовувалися:
а) перещеплювана лінія клітин тестикул поросят (ПТП), отримана з колекції культур клітин НДІ ветеринарії УААН;
б) суспензійні первинні культури мононуклеарних клітин людини, які виділяли з периферійної крові І(0) групи, взятої від здорових донорів;
в) тимоцити та спленоцити білих самців щурів лінії Вістар, вирощених у віварії біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка. Маса тварин - донорів складала 100-150 г. У роботі використовували тварин, які певний час утримувалися на карантині і не мали ознак захворювання. Утримання і поводження із піддослідними тваринами відповідало вимогам "Європейської конвенції з захисту прав хребетних, використовуваних для експериментальних і інших наукових цілей" (Страсбург, 1986). Для отримання клітин щурів забивали шляхом дислокації шийних хребців під легким ефірним наркозом, після чого проводили розтин та відбирали тимус і селезінку.
Вірус-індикатор. У якості такого вірусу для визначення інтерфероногенної дії індукторів використовували вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана, отриманий з музею НДІ епідеміології і мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї (Росія). Вірус розмножували на моношарі клітин ПТП. Інфекційний титр ВВС складав 108-109 ТЦД50/мл.
Буферні розчини та розчини реактивів. Для приготування таких розчинів наважки солей розчиняли у бідистиляті з наступним фільтруванням. За необхідності проводили стерилізацію розчинів автоклавуванням при 0,15 МПа (121°С) протягом 20 хв.
Фосфатно-сольовий буфер - ФСБ (Дюльбеко повний) готували на ізотонічному розчині NaCl з додаванням солей фосфатного буферу. Використовували для приготування МК, розчинення інших полірибонуклеотидних індукторів, промивання клітин, розведення глютарового альдегіду і ін.
Склад: NaCl - 8,0 г, КCl - 0,20 г, Na2HPO4 - 1,15 г, КH2PO4 - 0,20 г, CaCl2 - 0,10 г, MgCl2?6H2O - 0,10 г, води дистильованої до 1,0 л (рН 7,2). Розчини CaCl2 та MgCl2 стерилізували окремо.
0,02 % сольовий розчин версену використовували для зняття моношарових культур з поверхонь.
Склад: NaCl - 12,0 г, КCl - 0,30 г, Na2HPO4 - 3,93 г, КH2PO4 - 0,03 г, Na-ЕДТА - 0,30 г, води дистильованої до 1,5 л.
Буфер для виділення клітин (БВК). Склад: NaCl - 120 мМ, КCl - 5 мМ, Na2HPO4 - 3 мМ, HEPES - 5 мМ, глюкоза - 10 мМ, NaHCO3 - 4 мМ. За допомогою 0,1 M NaOH доводили рН розчину до 7,4. Після цього додавали СаСl2 - 1,2 мМ і МgSO4 - 1 мМ (по 1 мл). БВК використовували для виділення лімфоцитів селезінки та тимоцитів щурів.
Розчин фікол-урографіну. 4,5 г фіколу розчиняли в 50 мл гарячої води. Додавали 20 мл розчину для урографії "Trasograph". Компоненти
- Киев+380960830922