РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили в лаборатории кафедры фармакологии Луганского государственного медицинского университета (ЛугГМУ), сертифицированной Государственным фармакологическим центром (ГФЦ) МЗ Украины (свидетельство № 41 от 30 мая 2002 г. и № 07 от 29 сентября 2005 г.) согласно требований Комиссии по биоэтике ЛугГМУ (приказ ректора № 3 от 10.11.2005г.) в соответствии существующими с методическими рекомендациями ГФЦ МЗ Украины [256,257], а также правилами GLP [258-260].
Опыты выполнены на 755 белых половозрелых обоего пола беспородных крысах массой 150-200 г. Животные находились в условиях вивария ЛугГМУ и получали стандартную диету в виде гранулированного корма по установленным нормам. Доступ к воде был свободным. Эвтаназию животных осуществляли передозированием эфирного наркоза согласно требованиям Комиссии по биоэтике ЛугГМУ.
Экспериментальной моделью служил патологический процесс, развивающийся у животных в условиях замкнутого пространства. Моделирование гипоксии с нарастающей гиперкапнией проводили путем помещения крыс в изолированные стеклянные гермообъемы (10 дм3) с экспозицией 45 минут.
Другую форму гипоксии - гипоксическую гипоксию на фоне гипертермии - моделировали в специально разработанной сотрудниками кафедры фармакологии ЛугГМУ камере [10], в основу принципа работы которой положено вытеснение кислорода с помощью газообразного азота, подаваемого со скоростью 10 л/мин в первую минуту экспозиции и в последующем - со скоростью 0,4 л/мин. Содержание кислорода в камере составляло 10 об%. Контроль за содержанием кислорода и углекислоты проводили с использованием масс-спектрометра "МХ-6203". Температура воздуха в гермокамере составляла 42?С и поддерживалась автоматически с помощью реле, вмонтированных в ее стенки.
В скрининговой серии исследований использовались 16 оригинальных производных тиазолидина. Субституенты (Les-1 - Les-16) синтезированы в лаборатории кафедры фармацевтической, органической и биоорганической химии Львовского национального медицинского университета им. Даниила Галицкого профессором Р.Б. Лесыком.
Первичный фармакологический скрининг потенциальных антигипоксантов среди 16 оригинальных соединений производных тиазолидина проводили на модели гипоксической гипоксии с гиперкапнией, развиающейся в условиях замкнутого пространства. Затем скрининговые исследования проводили на модели гипоксической гипоксии с гиперкапнией на фоне перегрева среди 8 наиболее активных субституентов. В качестве референтного препарата использовали кверцетин ("Борщаговский ХФЗ", Киев) в виде 1 % водно-крахмальной взвеси [10]. Все используемые в скрининге соединения вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг в виде 1 % растворов за 60 минут до начала моделирования патологии. Каждая группа животных состояла из 8 крыс.
При выборе доз вводимых оригинальных химических соединений исходили из многолетнего опыта работы сотрудников кафедры фармакологии ЛугГМУ в области фармакологической коррекции экстремальных состояний гипоксического генеза [10-12,14,22,261,263-265].
Растворителем для водорастворимых соединений (Les-1-3 - Les-13-16) служила вода для инъекций (ампулы по 5мл, "Дарница", Украина), для жирорастворимых (Les-4-12) - димексид (флаконы по 100 мл "ЛХФЗ" Луганск, Украина) в соотношении с водой для инъекций 1:9.
Исходя из экспериментально установленной средней продолжительности жизни животных, подверженных воздействию гипоксии замкнутого пространства, в контрольной и опытной группах, для каждого потенциального антигипоксанта рассчитывали коэффициент противогипоксической защиты (Кз) [257], а также относительный показатель увеличения времени жизни животных (П) [266]:
; , где
Топ - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе;
Тк - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе.
Крыс, подверженных воздействию гипоксической гипоксии с гиперкапнией на фоне температурного стресса, извлекали из камеры в конце 12 минуты экспозиции. При таком кислородном и температурном режимах воздействия гибель животных в контрольной группе (без введения препаратов и субституентов) составляла 12,5 %, что обеспечивало наиболее адекватную модель гипоксического синдрома для решения поставленных в работе задач.
Эффективность изучаемых потенциальных антигипоксантов оценивали по выживаемости (разность между процентами выживших крыс в опытной и контрольной группах) [257]:
Эффективность = ВЖоп - ВЖк , где
ВЖоп - выживаемость в опытной группе, %;
ВЖк - выживаемость в контрольной группе, %,
по течению клинической картины при исследуемой форме гипоксии, определяя при этом в динамике состояние центральной и вегетативной нервных систем, а также по срокам гибели крыс в постгипоксическом периоде. Контрольную группу составляли животные, подвергшиеся острой гипоксической гипоксии, которым вводили эквиобъёмное количество физиологического раствора натрия хлорида ("Дарница", Украина) либо димексида (флаконы по 100 мл "ЛХФЗ" Луганск, Украина).
В отдельной серии токсикометрических исследований производного тиазолидина 5-фенилпропенилиден-роданин-3-пропионата натрия под лабораторным шифром Les-15, как наиболее активного соединения по результатам скрининговых исследований, изучали острую токсичность с использованием метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности [267]. Les-15 вводили внутрибрюшинно однократно в виде 2% водного раствора в дозах 600, 700, 800, 1000 и 1200 мг/кг массы животных. При этом клиническую картину интоксикации животных оценивали в соответствии с методическими рекомендациями ГФЦ МЗ Украины [256].
Для оценки степени потенциальной и реальной опасности острых и хронических отравлений Les-15 были рассчитаны такие токсикометрические параметры как абсолютная токсичность (1/LD50), зона токсического действия (LD84/LD16), интегральный коэффициент (1/LD50·tg?), функция угла наклона (S=(LD84/LD50+ LD50/LD16) /
- Киев+380960830922