Розділ 2
МАТЕРІАЛИ та МЕТОДи ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкти та предмети дослідження
2.1.1. Характеристика лабораторних тварин, залучених до експериментальних
досліджень. Експериментальні дослідження виконані із залученням 340 білих
нелінійних статевозрілих щурів-самців, а також щурів-самців лінії Wistar масою
220 – 250 г, 24 кролях-самцях масою 2,5–3,0 кг та 30 морських свинках середньою
масою 450-550 г.
Догляд, утримання та годівля тварин здійснювалися відповідно до вимог
нормативних документів [25, 54] в стандартних умовах віварію ДДМА. У ході
експерименту дотримувались етичних вимог до дослідження експериментального болю
у тварин із збереженням свідомості, затверджених Комітетом з експериментальних
досліджень та етичних проблем Міжнародної Асоціації з вивчення болю (IASP)
[134, 238]. Тварини були розподілені на серії для адаптації моделі, дослідження
стану гіпералгезії на рівні спинного мозку, виявлення ролі механізмів
пероксидації та антиоксидантного захисту у виникненні та підтримці стану
гіпералгезії у спинному мозку, а також можливості його фармакологічної
корекції.
2.1.2. Перелік використаних препаратів. В експериментальних дослідженнях
використані наступні фармакологічні засоби [43, 101]:
1. Місцевоанестезуючі засоби: лідокаїн - 100 мкг, 200 мкг та 400 мкг (2 %, 10 %
розчини лідокаїна гидрохлориду в ампулах по 2 мл, “Здоров’я”, Україна);
бупівакаїн - 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг (0,5 %, 0,75 % розчини в ампулах по 5
мл, “Здоровье народу”, Україна).
2. б2-адреноміметик клонідин (клофелін) - 5 мкг, 10 мкг (0,01 % розчин
клофеліну в ампулах по 1 мл, “Фармак”, Україна).
3. Антиоксидантні засоби: корвітин - 5 мг, 10 мг (водорозчинна форма, комплекс
кверцетина з полівінілпірролідоном 0,5 г во флаконах, ЗАТ НВЦ “Борщагівський
хіміко-фармацевтичний завод”) та тіотриазолін - 5 мг, 10 мг (1% розчин в
ампулах по 2 мл “Галичфарм”, Україна).
4. 18 нових активних сполук у ряду структурних аналогів хінолонів та
хіназолонів (0,5 %, 2 % р-ни).
5. Натрію хлорид, 0,04 мл (0,9 % розчин в ампулах по 10 мл, “Галичфарм”,
Україна).
Всі препарати у вказаних дозах вводились тваринам експериментальних груп –
інтратекально в дозованому об’ємі 0,04 мл. Фізіологічний розчин (0,9 % розчин
хлориду натрію) вводився в об’ємі 0,04 мл інтратекально тваринам контрольної
групи та внутрішньошкірно в об'ємі 0,25 мл.
Дози препаратів відповідали загальноприйнятим в експериментальних роботах на
тваринах [10, 129].
Тестування експериментальних тварин починали через 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60
хвилин (іноді до 120 – 180 хвилин за мірою необхідності) після одноразового
введення місцевоанестезуючих засобів або фармакологічних засобів інших груп.
2.2. Методи дослідження больової чутливості
2.2.1. Методи вивчення антиноцицептивної та анестезуючої активності
досліджуваних препаратів. Вивчення анальгетичного ефекту досліджуваних
препаратів проведене згідно етичних вимог до дослідження експериментального
болю у тварин із збереженням свідомості, затверджених Комітетом з
експериментальних досліджень та етичних проблем Міжнародної Асоціації з
вивчення болю (IASP) [238].
Для оцінки антиноцицептивного потенціалу досліджуваних препаратів нами
застосований альгометричний тест, оснований на сомато-сенсорних реакціях тварин
при дії електричного подразника – метод електрошкірного подразнення кореня
хвоста щура [100, 129], суть якого полягає в наступному.
Гризунам під шкіру дистальніше 10 мм від кореня хвоста вводились стальні
голчасті електроди діаметром 0,5 мм с фіксованою міжелектродною відстанню (10
мм). Оцінку больової чутливості здійснювали у вихідному стані (через 2-3
хвилини після введення електродів, коли тварина повністю заспокоювалася), а
також через 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60 хвилин (іноді до 120 – 180 хвилин за
мірою необхідності) після одноразового введення фармакологічних засобів по
появі голосової реакції (писк, вокалізація) у відповідь на поступово зростаюче
електричне подразнення від електростимулятора ЕСЛ-1 з прямокутними імпульсами
10 мс та частотою стимуляції – 100 Гц. Тривалість подразнюючої дії в кожному
окремому випадку не перевищувала 1 с. Розміри больових порогів виражали у
вольтах.
Реакція вокалізації у відповідь на електричне подразнення кореня хвоста
реалізується із залученням як сегментарного, так і супрасегментарного рівнів
замикання аверсивних сигналів, тому саме даному методу оцінки аналгезії ми
надали перевагу перед іншими альгометричними тестами, які також широко
застосовуються в експериментальній практиці вивчення ноцицептивної чутливості
(метод “hot plate”, “запального процесу”, “tail flick”). В основі черговості
появи ефектів у відповідь на зростаючу інтенсивність електричної стимуляції
лежить принцип ієрархії, залежний від рівня інтеграції ноцицептивного сигналу в
ЦНС: рефлекс відсмикування хвоста – спинний мозок, вокалізація під час
подразнення – стовбур мозку, вокалізація, що триває довше за період
подразнення, – таламус/ріненцефалон.
Оцінювання моторного блоку, що виникає при інтратекальному введенні препаратів,
визначали по 5–ти бальній системі, яка відповідає експериментальним
дослідженням. 0 балів - тонус хвоста збережений, рухи його спостерігаються в
повному об'ємі; 1 бал - збереження тонусу хвоста, але в одному положенні він не
утримується; 2 бали - ослаблення тонусу хвоста, рухи мляві; 3 бали - зниження
тонусу хвоста і можливість незначних рухів кореня хвоста при подразненні вище
розміщених сегментів шкіри, що не входять в зону анестезії; 4 бали - загальна
атонія хвоста, поява деяких рухів у відповідь на подразнення; 5 балів - ста
- Київ+380960830922