РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження проводили в лабораторії фармакології і тканинної терапії ІОХіТТ ім. В.П. Філатова МОЗ України, яка була тричі сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення 1995р. № 5, 2001р. № 19, 2006 р. № 31) у повній відповідності з вимогами комісії з біоетики ІОХіТТ (наказ № 8 від 7.11.06 р.), Правилами проведення робіт з використанням експериментальних тварин", Страсбург, 1986; Закону України № 3447-IV "Про захист тварин від жорстокого поводження" від 13.03.06), та Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України [81].
Роботу виконано на 159 кролях породи Шиншила масою 1,8 - 6,0 кг, 120 білих щурах лінії Wistar масою 180-220 г, 94 нелінійних білих мишах масою 20-22 г, 35 жабах, вирощених у розплідниках віваріїв ОДМУ та ІОХіТТ. Всі тварини були статевозрілі, обох статей, знаходились в умовах віварію ІОХіТТ на стандартному раціоні за встановленими нормами.
Водний екстракт буркуну (ЕБ) для ін'єкцій виготовлено з трави буркуну лікарського в лабораторії фармакології і тканинної терапії ІОХіТТ за методом академіка В.П. Філатова, технологію запатентовано (Патент України на корисну модель № 3544 "Спосіб одержання водного екстракту буркуну" від 15.11.04 р.).
ЕБ містить кумарини, глікозиди, флавоноїди з Р - вітамінною активністю, амінокислоти, пептиди, вуглеводи. ЕБ - стерильна прозора рідина світло-коричневого кольору з приємним кумариновим запахом. В якості референтного препарату використовували - тканинний препарат ФіБС, який відноситься до фармакотерапевтичної групи біогенних стимуляторів, що регулюють метаболичні процеси [156, 299]. Він є продуктом відгону лиманої грязі, з додаванням синтезованих кумарина і коричної кислоти, які за даними Кашинцевої Л.Т., [99] та Проніної О.О. [192] визначають його антикоагулянтні властивості.
Наведені в огляді літератури дані про біологічну дію фенольних сполук дозволили припустити наявність у ЕБ різних видів фармакологічної дії. Виходячи з мети і завдань дисертаційної роботи, експериментальні дослідження доцільно було побудувати таким чином: ідентифікувати і визначити кількість кумариноподібних речовин - основних діючих компонентів ЕБ, вивчити гостру і субхронічну токсичність, дослідити біологічну активність на тестах, призначенних для препаратів з природної сировини. Наявність кумаринів передбачало вивчення його антиагрегаційних, антикоагулянтних і фібринолітичних властивостей. Було досліджено вплив ЕБ на детоксикаційну функцію печінки інтактних тварин і при моделюванні токсичного ураження печінки, потенційні антитоксичні, антиоксидантні та мембраностабілізуючи властивості.
Розробка метода ідентифікації проводилась за допомогою хромотографічного та спектрофотометричного методів аналізу.
Визначення в ЕБ кумарину і двох оксікумаринів (скополетин, умбеліферон) проводилося після екстракції їх з препарату хлороформом з наступною хроматографією [78] на пластинках "Сорбфіл" ПТСХ-АФ-А-УФ у суміші розчинників циклогексан Р-ацетон Р - 2-пропанол Р (20:4:1).
Наявність кумаринів встановлювалося в УФ світлі при довжині хвилі 366 нм після обробки лужним розчином (гідроксидом калію).
Приготування випробуваного розчину. 10 мл препарату поміщали у ділильну лійку об'ємом 50 мл, додавали 10 мл натрію хлориду насиченого розчину 15 мл хлороформу і екстрагували протягом 1 хв. Після повного поділу шарів хлороформний витяг збирали у круглодонну колбу об'ємом 100 мл. Операцію екстракції хлороформом повторювали ще два рази, використовуючи по 15 мл хлороформа. Об'єднані хлороформні витяги упаривали до сухого залишку на водяній бані під вакуумом, додавали 0,5 мл ацетону, перемішували.
Приготування розчину порівняння. 5 мг кумарину (Fluka) поміщали у мірну колбу об'ємом 10 мл, розчиняли у 5 мл ацетону, доводили обсяг розчину до мітки і перемішували.
На лінію старту хроматографічної пластинки "Сорбфіл" розміром 5х10 см наносили смугою близько 1 см 10 мкл випробуваного розчину і 10 мкл розчину порівняння кумарину. Пластинку сушили на повітрі протягом 10 хв, потім поміщали у камеру із сумішшю розчинників циклогексан-ацетон-2-пропанол (20:4:1) і хроматографірували висхідним способом. Коли фронт розчинників проходив близько 8 см, пластинку виймали з камери, сушили на повітрі протягом 10 хв і обприскували розчином калію гідроксиду спиртовим.
Приготування розчину ЕБ для кількісного визначення кумарину. 2 мл препарату поміщали у колбу місткістю 50 мл додавали 25 мл 96 % спирту, перемішували, доводили обсяг розчину цим же розчинником до мітки і перемішували. Отриманий розчин фільтрували через лійку зі складчастим фільтром (синя стрічка).
Далі 5 мл фільтрату поміщали у мірну колбу об'ємом 25 мл, доводили обсяг розчину 96% спиртом до мітки і знову перемішували.
Кількісне визначення суми кумаринів і дослідження спектрів поглинання проводилося на спектрофотометрі СФ-46 у кюветі з товщиною шару 1 см при довжинах хвиль 240-360 нм, використовуючи як розчин порівняння 96 % спирт.
Вміст суми кумаринів (Х) у препараті, у відсотках, у перерахуванні на кумарин, розраховували по формулі:
, де
D - оптична щільність випробуваного розчину;
734 - питомий показник поглинання кумарину при довжині хвилі
272 нм;
V - об'єм препарата, в мл
Були досліджені наступні спектри поглинання спиртових розчинів: кумарину (Fluka); після попередньої екстракції агликонів кумаринів хлороформом з ЕБ; після гідролізу препарату хлористоводородною кислотою з наступною екстракцією агликонів кумаринів хлороформом з гідролізата; ЕБ без попередньої пробопідготовки [78].
Дослідження нешкідливості ЕБ проводили згідно до методичних рекомендацій [81] на 2-х видах лабораторних тварин (миші і щури) при одноразовому підшкірному і внутрішньочеревинному введенні (n=10). Використовувалися дози з обліком максимально припустимих фізичних обсягів введення рідин [203]. Рівень токсичності оцінювали за зміною поведінкових реак
- Київ+380960830922