РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Постановка досліду і об'єкт досліджень
Експерименти проведено на 48 статевозрілих морських свинках, які вважаються найбільш придатними для даних досліджень. Маса тіла становила 550-600 г. При проведенні дослідів дотримувались "Правил використання лабораторних тварин", 1984, додаток 4. Робота виконана в рамках комплексної наукової програми кафедри гістології, цитології та ембріології Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. ,,Горбачевського "Зміни в ксенодермотрансплантатах при впливі на них фізичних чинників та ефективність їх використання у хворих з опіковою травмою" (держбюджетна НДР, номер держреєстрації 0105U004112). Автор є виконавцем даної НДР.
Опікову травму відтворювали згідно методики, розробленої на кафедрах біохімії та гістології Тернопільського медуніверситету. Опік наносили під загальним ефірним наркозом водяною парою при температурі 96-97 0С на епільовану поверхню шкіри спини протягом 60 секунд. Розміри ділянки враження визначали за спеціальною таблицею [34], вона становила 18-20 % поверхні тіла тварин. Результати гістологічних досліджень пошкодженої шкіри засвідчили глибину враження, що відповідає опіку ІІІА-ІІІБ ступеня.
Піддослідні тварини були розділені на такі групи:
- інтактні морські свинки - 12 голів;
- тварини з некорегованою опіковою патологією - 18 голів;
- опечені тварини, яким проводилась рання некректомія, з використанням ліофілізованої ксеношкіри - 18 голів.
Тварини всіх груп утримувались на загальноприйнятому раціоні віварію Тернопільського медичного університету. При щоденному огляді контролювали загальний стан, ступінь прояву місцевих змін в ділянці опікової рани, масу тіла і летальність морських свинок.
Об'єктом дослідження була печінка, яка виконує в організмі досить складну та багатосторонню функцію, головним чином в обміні речовин., а також важливу роль відіграє у патогенезі опікової хвороби [41].
Для дослідження цих морфофункціональних змін та регенераторних процесів в печінці при тяжких опіках та використанні ліофілізованої ксеношкіри після ранньої некректомії, частину тварин декапітували за допомогою гільйотини в строки, що, згідно сучасної класифікації [37, 43], відповідають стадіям опікової хвороби: на 7, 14 і 21 добу (відповідно - стадії ранньої і пізньої токсемії та септикотоксемії). Перед забором матеріалу оглядали опікову поверхню, відзначали особливості опікового струпа і наявність чи відсутність гнійних ускладнень в ділянці рани. Після евтаназії за допомогою гільйотини під рауш-наркозом тварин розтинали і протягом 10 хвилин забирали печінку від 3-6 тварин, щоб фіксувати матеріал до початку розвитку посмертних змін. Одночасно забирали кров для вивчення токсичності плазми крові.
2.2 Методи дослідження та їх обгрунтування
Для виконання поставлених завдань використовували такі методики: гістологічні, гістохімічні, біохімічні, електронномікроскопічні, морфометричні, статистичні.
Для гістологічного дослідження шматочки печінки фіксували в 10 % нейтральному розчині формаліну та фіксаторі Ліллі, з наступною заливкою в парафін. Отримані на санному мікротомі зрізи фарбували гематоксиліном-еозином [54, 55]. Ці класичні методи досліджень дають можливість вивчити структуру тканин печінки в нормі, а також характер і глибину морфологічних змін, послідовність розвитку дистрофічних, некробіотичних та відновних процесів при тяжкій опіковій травмі та лікуванні з використанням ліофілізованої ксеношкіри.
Гістологічні препарати досліджували у світлооптичному мікроскопі і документували за допомогою мікроскопа ЛОМО Биолам И і системи виводу зображення гістологічних препаратів.
При дослідженні структурних змін печінки звертали увагу на стан судинної системи паренхіми органу і основні ультраструктурні компоненти.
Для характеристики морфофункціонального стану печінки важливим є перебіг обмінних процесів у судинах та жовчних капілярях, про які судили за активністю лужної фосфатази, локалізованої на структурах стінки гем окапілярів і жовчних капілярів. Важливість вивчення цього фермента також полягає в тому, що приймаючи участь в метаболізмі клітини, здійснює каталітичну дію (розщеплення та синтез), в тому числі різних макромолекул, включаючи складні компоненти нуклеїнових кислот, білків і ліпідів. Лужну фосфатазу виявляли гістохімічно за методом Гоморі [64, 23]. В основі методу лежить утворення сульфіду кобальту у вигляді осаду сірого та темно-сірого кольору.
Для вивчення динаміки компенсаторно-пристосувальних процесів печінки при важких опіках особливий інтерес представляє дослідження ключового ферменту циклу трикарбонових кислот - сукцинатдегідрогенази. Гістохімічно виявляли цей мітохондріальний фермент за методом Нахласа [64, 23]. Ці дослідження здійснювали на зрізах, виготовлених в мікротом-кріостаті з нефіксованої тканини з використанням нітро-синього тетразолю. Осад у вигляді гранул диформазана синього кольору свідчив про наявність і локалізацію ензима.
Для точнішого аналізу результатів гістохімічних досліджень використовували напівкількісний метод візуальної оцінки інтенсивності забарвлення мікроструктур у гістологічних реакціях [86]. З цією метою вираховували середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК), запропонований G. Astaldi and C. Verga, який є середньою відносною величиною концентрації досліджуваного інгредієнта, що виявляється в кожній окремій клітині [86].
Для напівкількісної оцінки активності сукцинатдегідрогенази в гепатоцитах використовувалась шкала візуальної оцінки [86]. Суть методу полягає у використанні бальної системи оцінки ступеня забарвлення структур такої градації: дуже низька активність (1 бал), мало великих гранул та відсутність порохоподібно-аморфного осаду барвника (1-а група); низька активність ферменту (2 бали) - мало великих гранул та мало порохоподібно-аморфного осаду барвника (2-а група); помірна активність ферменту (3 бали) - кількість порохоподібн