Розділ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Матеріали
2.1.1. Реактиви
Були використані: CNBr-активована Sepharose 4B ("Pharmacіa Bіotech", Швеція); сечовина, трихлороцтова кислота (ТХО), ацетон, хлористі амоній, натрій, калій, кальцій і магній ("Реахим", Росія); трис(гідроксиметил)амінометан (Trіs), дитіотреітол (ДТТ), 2-меркаптоетанол (2-МЕ), амонієва сіль 8-анілінонафталін-1-сульфонату (АНС), етилендіамінтетраацетат (ЕДТА) ("Serva", Німеччина); натрієві солі аденозин-5'-дифосфату (АДФ) і аденозин-5'-трифосфату (АТФ), фенілметилсульфонілфторид (PMSF), 3-циклогексиламіно-1-пропансульфонова кислота (CAPS) ("Sіgma", США); триетаноламін (ТЕА) ("Reanal", Угорщина).
Всі розчини готували на бідистильованій воді. Іонну силу розчинів розраховували за формулою: I = 1/2?(zi2 ? Ci), де zi - це заряд i іону, а Сi - його концентрація. Концентрацію сечовини визначали рефрактометрично за коефіцієнтом переломлення при довжині хвилі 589 нм [259].
2.1.2. Виділення та очищення GroEL і GroES
Стандартне очищення GroEL проводили після експресії в клітинах E. colі (штам HB101) мультикопійної плазміди pGroE4 (повний groE оперон E. coli, клонований в EcoR1 сайті вектора pACYC184) за відомою методикою [260]. Клітини суспендували в буфері, що містив 20 мM Tris-HCI pH 7.5, 1 мM ЕДТА, 5 мМ ?-меркаптоетанолу, 0.2 мM PMSF. Для руйнування клітин додавали лізоцим (1 мг/г клітин), після чого суспензію інкубували в льоді 10 хв. Руйнування клітин проводили ультразвуком п'ять разів при частоті 22 кГц протягом 45 с. Фрагменти зруйнованих клітин осаджували центрифугуванням протягом 30 хв при 30100 ? g і далі 30 хв при 105000 ? g. Для поділу фракцій GroEL й GroES освітлений розчин наносили на колонку (1.6 ? 20 см) DEAE-Toyopearl ("Toyo Soda", Японія), урівноважену буфером 20 мM Tris-HCI pH 8.0. При елюції в лінійному градієнті NaCl (від 0.0 до 0.7 М) фракції GroES виявлялися (за даними SDS-електрофорезу) у першій третині, а GroEL - у середині градієнту. Потім фракції GroEL діалізували проти буферу, що містив 20 мМ гістидину pН 6.0, і наносили на колонку MonoQ ("Pharmacia Biotech", Швеція), урівноважену тим самим буфером. Елюція GroEL спостерігалася наприкінці градієнту NaCl (0 М ? 0.6 М). Наступний етап очищення GroEL проходив на колонці MonoS ("Pharmacia Biotech", Швеція), урівноваженій буфером 20 мМ гістидин-HCl рН 5.3 у градієнті від 0 до 0.6 М NaCl. Переважний пік, що був елюйований наприкінці лінійного градієнту NaCl (0 М - 0.6 М), містив GroEL з незначною домішкою інших білків. Остаточне очищення (а також зміна буферу) здійснювалося на колонці (1.6 ? 50 см) Superose 6 ("Pharmacia Biotech", Швеція). Буфер містив 20 мM Tris-HCl pH 8.0.
Після стандартного виділення GroEL зазнавав додаткового очищення від міцно асоційованих з ним поліпептидних домішок, що містять триптофан, з використанням хроматографічної колонки Butyl-Toyopearl 650 ("Tosoh", Японія), урівноваженої 25 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ДТТ і 10% сульфату амонію. Концентрація сульфату амонію в буфері елюції (25 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 1 мМ ЕДТА) зменшувалася лінійно, і GroEL елюювали з колонки при 0% сульфату амонію [16]. Чистоту GroEL визначали методами SDS-електрофорезу в поліакриламідному гелі [261] і флуоресцентної спектроскопії за відсутністю триптофанової флуоресценції в препаратах GroEL. Нативність очищеного GroEL перевіряли за АТФазною активністю [262].
2.1.3. Білкові мішені для GroEL
В якості білкових мішеней GroEL було використано наступні білки: цитохром с серця коня ("Sіgma", США), з якого було отримано апоцитохром відповідно до методики, описаної Фішером [263]; рибонуклеаза А підшлункової залози бика ("Sіgma", США); альфа-лактальбумін молока людини ("Sіgma", США); лізоцим білка курячого яйця ("Реахим", Росія); бета-казеїн молока корови ("Sіgma", США); пепсин слизової оболонки шлунка свині ("Sіgma", США). Пепсин, апоцитохром с і бета-казеїн відомі як денатуровані в нейтральних pН білки [263-267]. Денатурація яєчного лізоциму, альфа-лактальбуміну й рибонуклеази А при нейтральних pН здійснювалася відновленням внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків додаванням 20 мМ дитіотреітолу (ДТТ).
Концентрацію білків визначали спектрофотометрично за поглинанням при 280 нм, використовуючи коефіцієнти поглинання (), рівні 0.9 для апоцитохрому с, 0.6 для рибонуклеази А, 1.6 для альфа-лактальбуміну, 2.7 для лізоциму, 0.5 для бета-казеїну, 1.4 для пепсину, 0.14 для GroES, 0.25 для GroEL після стандартного очищення й 0.19 для GroEL після додаткового очищення від домішки, що містить триптофан. Спектри поглинання реєстрували за допомогою спектрофотометра UV-1601 ("Shimadzu", Японія). Заряд білків розраховували за їх амінокислотною послідовністю при pН 7.5 (негативно заряджені аспарагінова й глутамінова кислоти, позитивно заряджені аргінін і лізин). Молекулярну масу білків оцінювали, виходячи з їхньої амінокислотної послідовності.
2.2. Афінна хроматографія
2.2.1. Приготування афінних сорбентів
Афінні сорбенти було створено на основі CNBr-активованої агарози (Sepharose 4B) за відомою методикою [268]; схему реакції представлено на малюнку 2.1. 20 мг білка в буфері (0.1 М NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 9) інкубували 16 годин з 6 мл BrCN-активованої Sepharose при безперервному перемішуванні при 4°С. Білок, що не прореагував, відмивали тим самим буфером та визначали кількість цього білка спектрофотометрично (завжди ~10%). Активні групи, що залишилися, блокували шляхом інкубації в буфері (0.1 М Trіs-HCl, pН 8) протягом 16 годин при 4°С. Отриманий афінний сорбент промивали тричі (кожен цикл складався із промивання ацетатним буфером (0.1 М, pН 4), що містив NaCl (0.5 М), а потім буфером Trіs-HCl (0.1 М, pН 8), що містив NaCl (0.5 М)). Приготовані в такий спосіб сорбенти зберігали при 4°С.
2.2.2. Умови афінної хроматографії
В роботі було використано хроматографічні колонки 5 ? 25 мм. Експерименти проводили за кімнатної температури в стандартному 20 мМ Trіs-HCl буф