РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Схема досліджень. Експериментальні дослідження здійснювали протягом 2003-2006 рр. у лабораторіях кафедри екології та біології ЛДАУ, лабораторії токсикології ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок, лабораторії нейрогуморальної регуляції Інституту біології тварин УААН. Було закладено дві серії дослідів. Першу серію дослідів проводили на 24 щурах-самцях лінії Вістар, масою 200 - 220 г, з яких було сформовано 4 - ри групи тварин: 1 - контрольна група (вводили питну воду через металевий зонд в об'ємі, який еквівалентний об'ємам водних розчинів солей Cd2+ і Pb2+); 2 дослідна група - вводили 16,6 % водний розчин ацетату свинцю в дозі 250 мг/кг (що відповідає 1/20 DL50); 3 дослідна група - вводили 0,029 % водний розчин хлориду кадмію в дозі 4,4 мг/кг (що відповідає 1/20 DL50); 4 дослідна група - вводили комбінацію свинцю ацетату та кадмію хлориду в дозах 125 та 2,2 мг/кг (що відповідає 1/40 DL50 кожної з солей) (табл. 2. 1).
Таблиця 2. 1
Схема I серії досліду
Дослідні групи
(по 6 тварин) Інтоксикація тварин важкими металами (внутрішньошлунково, протягом 30 днів) 1 Вода 2 Pb2+ 1/20 DL50 3 Cd2+ 1/20 DL50 4 Pb2+ 1/40 DL50 +Cd2+ 1/40 DL50
Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. Щурів декапітували на 30 - тий день під легким ефірним наркозом. Після розтину у тварин брали кров, головний мозок, легені, серце, селезінку, печінку, нирки для біохімічних досліджень.
Другу серію дослідів проводили на 78 щурах-самцях лінії Вістар, масою 140 - 160 г сформованих у 13 груп (табл. 2. 2).
Таблиця 2.2
Схема II серії досліду
Дослідні групи
(по 6 тварин)Токсичне ураження солями важких металів (внутрішньо-
шлунково, протягом 7 днів)Корекція токсичного ураження (7 днів)1вода-------------2Pb2+ 1/3 DL50--------------3Cd2+ 1/3 DL50--------------4Pb2+ 1/6 DL50 +Cd2+1/6 DL50-------------5Pb2+ 1/3 DL50в/в ліолів6Pb2+ 1/3 DL50в/м селеніт натрію7Pb2+ 1/3 DL50в/в ліолів + в/м селеніт
натрію8Cd2+ 1/3 DL50в/в ліолів9Cd2+ 1/3 DL50в/м селеніт натрію10Cd2+ 1/3 DL50в/в ліолів + в/м селеніт
натрію11Pb2+ 1/6 DL50 +Cd2+ 1/6 DL50в/в ліолів12Pb2+ 1/6 DL50 +Cd2+ 1/6 DL50в/м селеніт натрію13Pb2+ 1/6 DL50 +Cd2+ 1/6 DL50в/в ліолів + в/м селеніт
натрію
За контроль взяли 4 - ри групи тварин: 1 дослідній групі вводили питну воду через металевий зонд в об'ємі, який еквівалентний об'ємам водних розчинів солей Cd2+ і Pb2+, 2 дослідній групі вводили через металевий зонд ацетат свинцю у дозі 1650 мг/кг (що відповідає 1/3 DL50), 3 дослідній групі вводили через металевий зонд хлорид кадмію у дозі 29,3 мг/кг (що відповідає 1/3 DL50), 4 дослідній групі вводили через металевий зонд комбінацію солей свинцю та кадмію у дозах 3300 та 58,6 мг/кг (що відповідає 1/6 DL50 кожної з солей). Вводили солі досліджуваних металів протягом семи днів. У інших дослідних групах (5-13) після семиденної інтоксикації, проводили семиденну корекцію шляхом внутрівенного (в/в) введення гепактопротектору ''Ліолів" з розрахунку 15 мг/кг та внутрім'язевого (в/м) введенні селеніту натрію з розрахунку 100 мкг/кг. На 14 - тий день тварин декапітували під легким ефірним наркозом. Відбирали внутрішні органи. Із відібраних зразків тканин готували гомогенати на ізотонічному розчині хлориду натрію у співвідношенні 1:9. Інкубували 1 год. при низькій температурі після чого центрифугували протягом 15 хв при 3 тис. об./хв.
2.2. Розрахунок вагових коефіцієнтів органів. Розрахунок вагових коефіцієнтів органів проводили згідно методики [129]. Отримавши абсолютні показники маси органів визначали вагові коефіцієнти за формулою:
К = m1:m2,
де m1 - масса органа, г; m2 - масса тіла тварини, кг.
2.3. Визначення концентрації гемоглобіну в крові. Визначення концентрації гемоглобіну в крові проводили гемоглобін-ціанідним методом згідно методики [77]. В основі методу лежить здатність гемоглобіну окислюватись у метгемоглобін при взаємодії з гексаціанофератом калію (K3Fe(CN)6), який з ацетонціангідрином утворює забарвлений гемоглобінціанід. Інтенсивність забарвлення якого буде пропорційна вмісту гемоглобіну. При цьому до 5 мл трансформуючого розчину (ацетонціангідрин, ціаноферат калію, дикарбонат натрію) додавали 0,02 мл крові (розведеної в 251 раз). Оптичну густину визначали при довжині хвилі 500-560 нм. Вміст гемоглобіну розраховували за формулою:
Нв в г % = (Едос : Ест) ? 15,
де Едос - екстинція дослідної проби, Ест - екстинція стандартної проби, 15 - перерахунковий коефіцієнт.
2.4. Визначення кількості еритроцитів у крові. Підрахунок кількості еритроцитів проводили згідно методики [77]. При якій до 4 мл 0,9% розчин хлориду натрію вносили 0,02 мл крові (розведення 1:200). Еритроцити підраховували через 1хв після заповнення камери Горяєва при малому збільшенні мікроскопу. Підрахунок еритроцитів вели у 5 великих квадратах розміщених по діагоналі. Кількість еритроцитів в 1 мкл крові розраховували за формулою:
Х = (а?4000?200) : 80,
де Х - кількість еритроцитів в 1мкл крові, а - кількість еритроцитів у 80 малих квадратах, 4000 - множник для перерахунку результату в 1 мкл крові, так як об'єм малого квадрату становить 1/4000 мкл, 200 - ступінь розведення крові.
2.5. Визначення кількості лейкоцитів. Підрахунок кількості лейкоцитів проводили згідно методики [77]. У пробірку вносили 0,4 мл 3-х чи 5 % оцтової кислоти, пофарбованою метиленовою синькою, додавали 0,02 мл крові. Лейкоцити підраховували в 100 великих квадратах через 1 хв після заповнення камери Горєва при малому збільшенні мікроскопу. Розрахунок робили за формулою:
Х = (а?4000?20) 1600,
де Х - кількість лейкоцитів в 1 мкл крові, а - кількість лейкоцитів у 100 малих квадратах, 4000 - множник для перерахунку результату в 1мкл крові, так як об'єм малого квадрату становить 1/4000мкл, 20 - ступінь розведення крові, 1600 - кількість малих квадрат