РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Условия гипотермического хранения и нормотермической реперфузии печени
Для выполнения работы использовали белых беспородных крыс-самок массой 200-250 г (n=85). Исследования проводили согласно требованиям этического комитета ИПКиК НАН Украины и общим принципам планирования экспериментов на животных, одобренным Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, Украина, 2001) и согласованным с положениями "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, Франция, 1986). Все манипуляции с животными проводили под поверхностным эфирным наркозом.
В качестве ЦФТ использовали постмикросомальную фракцию гомогенатов фетальных тканей человека 8-10 недель гестации, полученную как описано в работе [67]. Эмбрионы были получены в специализированной клинике после письменного разрешения проинформированных доноров в результате планового прерывания беременности. ЦФТ хранили при температуре -80 ?С и, непосредственно после отогрева, вводили крысам в бедренную вену в дозе 0,3 мл на 100 г массы тела за 4 ч до изоляции органа. ЦФТ стандартизовали по содержанию белка, который составлял 1 ± 0,25 мг/мл.
2.1.1. Консервирующие растворы и среда для реперфузии
Приготовление сахарозо-содержащего раствора. Навески реактивов растворяли в 50 мМ трис-HCl буфере и охлаждали до 4 °С. После доведения pH в среду вносили 1% БСА фракции V или 1% ПЭГ-8000.
Приготовление модифицированного сахарозо-содержащего раствора. Навески реактивов растворяли в бидистиллированной воде и охлаждали до 4 °С. После доведения pH в среду вносили 1% ПЭГ-8000 и 100 мкМ ДНФ.
Для проведения нормотермической реперфузии изолированной печени использовали минимальный солевой раствор Кребс-Рингер-бикарбонат.
Приготовление раствора Кребс-Рингер бикарбонат. Навески реактивов растворяли в бидистиллированной воде и нагревали до 37 ?С. После доведения pH, среду насыщали в течение 3 мин газовой смесью, состоящей из 95% O2 и 5% CO2. Для всех использованных растворов значение рН составляло 7,4.
Состав используемых растворов приведен в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Состав растворов для гипотермического хранения изолированной печени и последующей нормотермической реперфузии
Компоненты растворовКонцентрация компонентов в растворах, мМССРССР
модифицированныйКребс-Рингер-
бикарбонатKCl5?4,8KH2PO40,45301,2Na2HPO40,515?CaCl20,80,52,6MgSO40,511,2NaCl??120NaHCO3??25Сахароза250250?Глюкоза??4,5HEPES??10Трис-HCl5050?БСА1%??ПЭГ-8000?1%? 2.1.2. Выделение изолированной печени крыс и ее гипотермическое хранение. Анестезированным животным вскрывали брюшную полость и в v. сava вводили гепарин (100 Ед). Затем под v. porta закладывали лигатуру, вводили и закрепляли в ней иглу. После начала перфузии надсекали v. cava inf. для обеспечения оттока перфузата из печени. Орган отмывали от крови охлажденным физиологическим раствором (25-30 мл) с использованием перистальтического насоса. Свидетельством правильного хода отмывки служило равномерное осветление ткани и отсутствие мозаичных пятен. Далее печень насыщали 50 мл охлажденного до 4 oC консервирующего раствора, со скоростью 2,5-3,0 мл/мин, чтобы создать в вене перфузионное давление равное 12 мм.рт.ст. После отмывки органа и наполнения его соответствующим консервирующим раствором в v. porta вводили катетер диаметром 1,4 мм, который фиксировали лигатурой. Печень с катетером аккуратно извлекали из тела животного и немедленно переносили в бюксы, наполненные охлажденным раствором. Орган полностью погружали в среду и хранили при температуре 0 - 4 ?С в течение 1 или 18 часов.
2.1.3. Нормотермическая реперфузия печени. После соответствующего срока холодового хранения печень извлекали из холодильника и подключали к системе реперфузии. Для удаления разобщителя орган отмывали 20 мл раствора Кребс-Рингер-бикарбонат, содержащего 1% БСА, в открытой системе. Затем проводили рециркуляционную перфузию печени 130 мл раствора Кребс-Рингер-бикарбонат (рН=7,4) в течение 60 мин при температуре 37 ?С. Предварительно в раствор вводили глюкозу (1 мг/мл) и насыщали газовой смесью (время газации 3 мин). Через 30 и 60 мин отбирали аликвоты перфузата для определения в нем активности ферментов.
После каждого срока хранения печени при 0 - 4 ?С и последующей нормотермической реперфузии от органа отрезали фрагмент ткани (0,5 г) для приготовления гомогенатов с целью дальнейших биохимических исследований.
2.1.4. Выделение митохондрий. Митохондрии выделяли при помощи дифференциального центрифугирования как описано в работе [19]. Навески печени массой 4 г помещали на 5 мин в охлажденную до 0 ?С бескалиевую среду выделения, содержащую 0,3 M сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl (t=26 ?C, рН=7,4). Затем печень продавливали рычажным прессом через отверстия диаметром 1 мм. Измельчённую ткань разводили в 10-12 раз средой выделения и гомогенизировали ручным гомогенизатором Даунса. Гомогенат центрифугировали при 600 g в течение 10 мин. Полученный супернатант центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Осадок митохондрий суспендировали в среде выделения и повторно центрифугировали при 10000 g. К осадку добавляли 2-3 мл среды выделения. Полученная таким образом суспензия митохондрий содержала 40 - 50 мг/мл белка.
2.1.4. Полярографическое измерение дыхания и фосфорилирования. Определение дыхательных параметров митохондрий проводили с помощью закрытого платинового электрода Кларка в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при 26 °С на полярографе "Rank Brother" model 20 (Великобритания), соединенном с персональным компьютером. В начале прибор калибровали средой измерения, предварительно насыщенной воздухом. Остаточный кислород электрода не превышал 5-6%, смещение нуля электрода - не более 0,3-0,5 нмоль O2/мин. Расчет скоростей потребления кислорода выполняли с помощью системного программного обеспечения. Добавка митохондрий в ячейку полярографа с