РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методи виділення анаеробних культур
Зразки торфу, ґрунту, води й мулу прісних водойм відбирали загальноприйнятими
методами: осади та воду морів – пробовідбірниками на експедиційних судах (НДС
"Професор Водяницький", "Академік Вернадський", "Бентос"). Накопичувальні
анаеробні мікроорганізми одержували при засіві поживних середовищ, водою, мулом
та ґрунтом із джерел з температурою 20, 30, 55, 60oС та pН 6,0–8,0.
Експерименти проводили на мінеральних поживних середовищах наступного складу:
Середовище № 1 "P"(розроблене нами) (г/л):
KH2PO4–0,4; K2HPO4•3H2O–0,4; NH4Cl–1,0; MgCl2•6H2O–0,1; CaCl2•2H2O–0,02; NaHCO3
–1,0; Na2S•9H2O–0,5; розчин 0,2% індикатору резазуріну – 1 мл; розчин
мікроелементів [167] – 1 мл/л; розчин вітамінів – 1 мл/л [209]; вітаміни в ряді
випадків замінювали дріжджовим екстрактом – 2 мл/л; вода дистильована – 1 л; pН
середо-вища 7,0–7,5.
Середовище № 2 за Pfennig [167] (мг/л):
KH2 PO4 –330; NH4 Cl – 330; MgCl 2•2H2 O–330; KCl–330; CaCl2 –330;NaHCO3 –1500;
Na2S•9H2O–500; резазурін – 2 мл; розчин вітамінів [209] – 10мл/л; розчин
мікроелементів–1 мл/л; pH середовища –7,0–7,3.
Середовище № 3 за Панцхава [41] (г/л):
KH2PO4 – 2,8; K2 HPO4 – 3H2 O–3,6; NH4Cl–2; MgCL2•6H2 O – 0,3; CoCl2•6H2O–0,08;
Fe2 SO4•7H2O – 0,04; NaHCO3 –2; Na2S•9H2O – 0,08; розчин мікроелементів – 1
мл/л; pH – 4,5–6,4 доводиться 10% HCl.
Середовище № 4 за Zeikus [218] (мг/л):
NH4Cl–0,9; NaCl–0,9; MgCl2–0,2; KH2PO – 0,75; K2HPO4 –1,5; розчин
мікроелементів – 9 мл; 10% Fe2SO4 – 0,03 мл; резазурін 0,2% – 1 мл; розчин
вітамінів [209] – 5 мл; 10% Na2S–10мл додається перед автоклавуванням. У
середовище № 4 вносили 0,3% дріжджового екстракту; 1% триптону та 0,5 глюкози
(автоклавували окремо); pH 7,2–7,5. Газова фаза аргон 100%.
Окремо готували робочий розчин індикатора резазуріна і розчини відновників
[12]. Цитрат титану Ш готували за Зендером [221], сірководень – як описано у
Таширева [52]. У роботі із середовищами, що містять перераховані вище
відновники і резазурін, як індикатор анаеробіозу, почервоніння середовища не
спостерігалося.
Для розливу середовищ використовували методику, що описана в роботі Чернишенко
[53]. Розлив середовищ здійснювали в безупинному струмі інертного газу, з
використанням зонду-фіксатору, розробленого нами [54]. Середовище розливали у
флакони об`ємом 30, 250, 500 мл, закривали пробками з бутилової гуми з
металевими ковпачками, що накручуються, або у пробірки розміром 20Ч20 мм, які
закривали пробками з чорної гуми і зверху туго прикручували дротом. Середовища
автоклавували при 1,5 атм. Флакони і пробірки, які автоклавували, поміщали в
металевий бікс, дотримуючи засобів безпеки, щоб при нагріванні не розірвало
судину або не вибило пробку. Обсяг середовища складав 1/3 обсягу судини.
Використовували інертний газ аргон (ДСТУ 10157–79), що містить O2 у
концентрації не вище 0,0007%. Це дозволило виключити етап очищення газів у
колонках від слідів кисню. Газові суміші, які містили водень і вуглекислий газ
у співвідношенні 4:1, вводили в культиватор без попереднього очищення, методом
витиснення. Використовували вуглекислий газ, що відповідає (ДСТУ 8050–85).
Водень одержували в апараті СГС-2, електрохімічним розкладанням 25% розчину
КОН.
Розчини вітамінів, вуглеводів, антибіотиків стерилізували фільтруванням крізь
фільтри "Синпор" № 8, 9 так, як описано у нашій роботі [60], зберігали окремо в
анаеробних умовах і вносили в середовище безпосередньо перед посівом, стерильно
шприцем.
Для виділення чистих культур з накопичувальних застосовували метод серійних
розведень з подальшим розсівом на агарізовані середовища з (2–2,5% агару) у
чашках Петрі, пробірки, чи "обертові" флакони [52, 12], з метою одержання
окремих колоній.
2.1.1. Виділення целюлолітичних і сахаролітичних бактерій
Для виділення накопичувальних целюлолітичних бактерій використовувалося
середовище № 1. Як вуглецевий субстрат застосовували: целюлозу (фільтрувальний
папір), торф, солому у кількості – 10г/л. Фільтрувальний папір різали на
смужки, подрібнювали в гомогенізаторі. Торф, солому подрібнювали механічним
шляхом. При виділенні чистих целюлолітичних культур застосовували целюлозу
(1об/%) або целобіозу (0,5%). Для сахаролітичних бактерій – целобіозу (0,5%)
або глюкозу (1%).
На першому етапі виділення накопичувальних целюлолітичних бактерій, вирощування
здійснювали у флаконах з 10 мл середовища, що містило джерело вуглецю –
фільтрувальний папір. Кількість инокуляту – 2мл. Час вирощування культур 5–7
діб, температура культивування 55– 60оС.
На наступному етапі, культури, що активно споживають целюлозу (зменьшення
субстрату оцінювали візуально за ступенем руйнування целюлози), висівали у
чашки Петрі або пробірки (зі скошеним агаром) на поверхню 2% сольового агару і
покривали посіви смужками фільтрувального папіру. Подальше виділення культур
проводили з ділянок зруйнованого фільтрувального паперу, що за звичай були
оточені зоною жовтого пігменту. Матеріал з таких плям пересівали на рідкі
середовища з целюлолітичними субстратами. Далі, культури, що інтенсивно
розкладають целюлозу в рідкому середовищі, розсівали методом граничних
розведень бактеріальної суспензії в пробірки з агаризованим середовищем із
джерелом вуглецю – целобіозою. Отримані поодинокі колонії, вирізували у виді
блоку і пересівали в рідке середовище з целобіозою або фільтрувальним папіром.
Флакони прогрівали при 100оС 5 хв для знищення вегетативної мікрофлори. На
останньому етапі виділення чистих культур, здійснювали розсів суспензії
повторними висівами в чашки Петрі або (пробірки зі скошеним агаром ) на
агаризован
- Киев+380960830922