РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Роботу виконано в Науково-виробничому центрі ветеринарної медицини птахівництва
факультету ветеринарної медицини Луганського національного аграрного
університету, а також на базі лабораторії молекулярної діагностики
Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної
ветеринарної медицини», в Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН
України, та 8-ми птахогосподарствах різних напрямків продуктивності.
Роботу з вірусоутримуючим матеріалом проводили в лабораторіях, які мають
регламентований наказом МОЗ України від 14.12.92 № 183 та ДСП 9.9.5?064?2000
дозвіл на роботу із мікроорганізмами ІІІ?ІV груп патогенності [255, 256].
Безпека робіт забезпечувалась відповідно до вимог ДСП № 9.9.5.035.99, ДСП
9.9.5.-080?2002 [257, 258]. Для дезінфекції використовували засоби, які мали
інструкцію щодо застосування, затверджену Головним державним санітарним лікарем
України, гарантованої ефективності та безпечності, внесені до Облікового
переліку Засобів в Україні та посвідчення про можливість застосування в
Україні. При роботі з культурами мікроорганізмів та в усіх інших випадках,
пов’язаних із зберіганням і рухом у межах та поза межами лабораторії,
керувались „Положением о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и
пересылке культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм,
бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения” [259]. Умови
мікроклімату виробничих приміщень відповідали ДСН 3.3.6.042?99, СН 535?81
[260]. Роботу з матеріалом, що містить віруси виконували в боксах із
використанням засобів індивідуального захисту, що відповідали характеру та
умовам роботи, забезпечували безпеку праці [261, 262, 263, 264].
2.1. Біологічні об'єкти, використані в дослідженнях
Курячі ембріони. Ізоляцію, культивування та визначення інфекційної активності
проводили з використанням КЕ 9–11-добової інкубації, які отримували від
батьківського стада птиці породи Арбор-Айкерс із птахогосподарства,
благополучного щодо інфекційних захворювань. Всього в роботі використано 310
КЕ.
Курчата. Для біопроби та циліостатичного тесту використано 296 курчат
3?13-добового віку породи Арбор-Айкерс.
Культури клітин. Культивування штамів ВІБК проводили в первинно-трипсинізованій
культурі клітин ФКЕ та перещеплюваній культурі клітин Vero, отриманій з
Колекції клітинних культур для ветеринарної медицини та біотехнології ННЦ
«Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».
Первинні культури клітин ФКЕ одержували за трипсинізацією ембріонів 11-добової
інкубації, яку здійснювали за дрібноциклічним диспергуванням тканини ембріонів
за загальноприйнятою методикою [265]. Після центрифугування клітинної суспензії
за 1500 об./хв. отриманий осад ресуспендували в живильному середовищі.
Життєздатність та концентрацію клітин визначали методом вітального фарбування 1
% водним розчином трипанового синього та їх обліку в камері Горяєва з
використанням світлового мікроскопа.
Ростове середовище, яке використовувалось під час роботи з культурами клітин,
складалось з суміші рівних об’ємів середовищ – 199 та Ігла, з додаванням 10 %
сироватки крові великої рогатої худоби та антибіотиків (бензилпеніцилліну-КМП
100 ОД/см3 та стрептоміцину 100 мг/см3), підтримуюче середовище було
аналогічним, за винятком сироватки крові. Культури клітин вирощували у флаконах
об’ємом 20 см3. Посівна концентрація складала 800 тис. клітин в 1 см3 поживного
середовища. Клітини інкубували за температури 37 °С у термостаті впродовж 24–48
годин до виповнення моношару. Для контролю контамінації ФКЕ будь-якими
мікроорганізмами проводили висів суспензії клітин у баксередовищах (МПБ, МПА,
середовище Сабуро, Ендо).
Штами вірусів. У дослідженнях використовували ізольовані та вакцинні штами
вірусу ІБК.
Ізолят ЛІ виділено з КЕ, отриманих від хворої на ІБК птиці 240?270-добового
віку, що належала СТОВ «Авіс» Лутугінського району Луганської області.
Ізолят ЛІ-1 виділений М. М. Ігнатовим у 2001 р. від птиці 240-добового віку,
хворої на інфекційний бронхіт, що належала СТОВ «Авіс».
Ізоляти ЛІ-2 та ЛІ-3 виділено від курей 150-добового віку породи
Хайсекс-коричневий з наявністю патолого-анатомічних змін, характерних для ІБК
(збільшення нирок та селезінки, гіперемія легень, оваріосальпінгіт, жовтковий
перитоніт), яка утримувалась у ВАТ «Сімейкінське» Краснодонського району
Луганської області.
Ізоляти ЛІ-4, ЛІ-5, ЛІ-6 виділено з КЕ, отриманих від птиці, що належала
відповідно ВАТ «Сімейкінське» та фермерським приватним птахогосподарствам
Краснодонського району Луганської області, що неблагополучні з ІБК.
У роботі використовували наступні вакцинні штами:
Н-120 (жива ліофілізована вакцина TAD ІВ vac I Н120, 5000 доз, 106,7 EID50,
штам Н-120 серотипу Массачусетс);
Ма-5 (жива ліофілізована вакцина Нобилис® ІВ Ма5, 2500 доз, 103,0 EID50 штам
Ма-5 серотипу Массачусетс);
4/91 (жива атенуйована вакцина Нобилис® ІВ 4/91, 1000 доз, 103,6 EID50 штам
4/91 серотипу 4/91).
Сироватки крові. Зразки крові птиці різних вікових груп з ВАТ «Сімейкінське»,
п\г «Чернухінська», ВАТ «Перевальський», СТОВ «Авіс» та «Агроукрптаха», а також
птиці, що знаходилась у досліді, відбирали з пахвової вени.
2.2. Серологічні дослідження
Серологічний моніторинг. Для визначення епізоотичної ситуації щодо ІБК
проведений серологічний моніторинг з урахуванням схем щеплення, рівня захисного
титру Ат (від 3,0 lоg2 у РНГА), кількості реагуючої птиці та її віку впродовж
періоду вирощування у ВАТ «Червоний прапор», п/ф «Лисичанська», ВАТ
«Сімейкінське», СТОВ «Авіс» та «Агр
- Киев+380960830922