ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования
Объектом исследования были 220 культур моноцитов и 210 культур нейтрофилов
периферической крови практически здоровых доноров-мужчин в возрасте от 20 до 24
лет. Забор крови в объеме 20 мл проводили из локтевой вены в утреннее время
(07.00-08.00) до еды. Кровь вносили в стерильные стеклянные пробирки,
содержавшие 0,2 мл гепарина, перемешивали и для получения плазмы отстаивали в
течение 2 ч в термостате при 37 °С. Полученную плазму крови в дальнейшем
использовали для выделения моноцитов и нейтрофилов.
Доноры, кровь которых использовали для проведения экспериментов, были тщательно
обследованы с целью исключения наличия и перенесенных острых и хронических
инфекционных и соматических заболеваний в течение предшествующих 6 месяцев и
стресса непосредственно перед забором крови.
Работу выполняли в соответствии с общепринятыми биоэтическими нормами с
соблюдением соответствующих принципов Хельсинской декларации прав человека,
Конвенции Совета Европы про права человека и биомедицины, а также
соответствующих законов Украины, касающихся проведения экспериментальных и
клинических исследований. Все лица, у которых брали кровь для исследования,
родители детей, больных хроническими функциональными колостазами (а по
возможности – и дети) дали письменное разрешение на проведение исследований.
2.2. Методы исследования
Моноциты из периферической крови здоровых доноров выделяли по методу H.R.
Recalde (1994) [51, 73, 134]. Чистоту суспензии моноцитов (89-98 %)
подтверждали иммунофлуоресцентным методом с использованием моноклональных
антител к рецепторам CD14 (Primary Anti-Human CD14; clone 2D-15C, ICN Ph.,
USA). Жизнеспособность клеток в суспензии подтверждали в тесте с трипановым
синим (она составляла 89-93 %).
Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров путём
центрифугирования через изотонический градиент плотности перколла (Sigma, США)
с последующим лизисом эритроцитов ледяным 155 миллимолярным раствором аммония
хлорид. Выделенные нейтрофилы дважды отмывали HEPES-буфером и взвешивали в
инкубационной среде в конечной концентрации 2 млн. клеток в 1 мл. Инкубационная
среда состояла из IMDM (Incove Modified Dulbecco Medium, Bio Whittaker,
Бельгия) с добавлением 10 % инактивированной фетальной телячьей сыворотки
(Gibco BRL, Великобритания), 100 МЕ/мл пенициллина (Yamanouchi, Япония), 100
мкг/мл стрептомицина (Gibco BRL, Великобритания) и 30 мкг глутамина (Sigma,
США). Клетки вносили в количестве 2 млн. (1 мл) в 24-луночные плашки (Nunc
Brand Products, Дания) и инкубировали в течение 22 ч при 37 °С в увлажнённой
атмосфере с 5 % углекислого газа.
Во всех опытах использовали моноциты и нейтрофилы в концентрации (0,5±0,025)
млн. клеток/мл.
После выделения моноциты и нейтрофилы разделяли на порции. Две порции каждых
клеток инкубировали в течение 3 ч с ТК (100 и 200 мг/л), еще две – с ПГН (100 и
200 мг/л) и еще две – с ЛПС (100 и 2000 мг/л). Интактные клетки не
контактировали со структурными компонентами бактерий. Время культивирования 3 ч
было выбрано в связи с тем, что активация клеток под действием ТК, ПГН и ЛПС
достигает максимального значения в течение 3 ч.
Бактерии, использованные для выделения из их клеточных стенок ТК, ПГН и ЛПС,
были изолированы нами из фекальных масс 389 детей 3-10 лет (301 мальчика и 88
девочек), страдающих хроническими функциональными колостазами (запорами). Они
были обследованы в 2005-2006 гг. в клинике хирургии детского возраста
Луганского государственного медицинского университета (при непосредственном
участии и с письменного разрешения заведующего кафедрой детской хирургии
доктора медицинских наук профессора Момотова Александра Григорьевича).
В стерильные пробирки с произвольной навеской кала (до 1 г) добавляли
стерильный изотонический раствор натрия хлорид из расчёта получения исходного
разведения (1:10). После тщательного перемешивания материала последовательно
0,5 мл взвеси распределяли в ряд пробирок с 4,5 мл изотонического раствора
натрия хлорид, достигая разведения (-9) lg. Затем 0,1 мл взвеси высевали на
плотные питательные среды в чашки Петри; посевы инкубировали 24-72 ч при
температуре 30 ?С, с последующей качественной и количественной оценкой
облигатной и факультативной микрофлоры.
Посев для выявления анаэробной микрофлоры производили немедленно в течение не
более чем 2 ч с момента забора материала на свежеприготовленный коммерческий
агар с лошадиной сывороткой и одним из антибиотиков (канамицин, гентамицин), а
также на обогащённую полужидкую тиогликолевую среду. Кроме того, материал
засевали на кровяной агар.
Для культивирования анаэробных неспорообразующих бактерий использовали
микроанаэростат, заполненный трёхкомпонентной газовой смесью (азот – 80 %,
водород – 10 %, углекислота – 10 %). Для выявления в нативном материале
бактерий рода Prevotella клинический материал просматривали в ультрафиолетовом
свете (люминесцентный микроскоп). Для идентификации анаэробных возбудителей на
четвёртом этапе лабораторного исследования (6-й-7-й день) использовали культуры
анаэробных бактерий, выросших на твердых и полужидких накопительных средах.
Исследуемые культуры идентифицировали до рода и вида по результатам изучения
культуральных, морфологических, тинкториальных, биохимических свойств и
чувствительности к антибиотикам.
Установление родовой принадлежности культур и видовую идентификацию бактерий
проводили согласно приказу Министерства здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля
1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериол
- Киев+380960830922