РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Растительный материал
Предметом исследования служили ДНК и РНК, полученные из следующих источников.
I. Подсолнечник (Helianthus annuus L.) сорта Передовик:
-2-дневные этиолированные проростки,
а также развивающиеся в ходе дальнейшего роста и дифференцировки их клеток
- корни 5-дневных этиолированных проростков,
-зелёные листья первого яруса 20-22 дневных растений
Элитные семена подсолнечника предоставлены нам доктором биологических наук Г.В. Пустовойт (ВНИИМК, Краснодар).
Семена подсолнечника стерилизовали в 30 %-м пероксиде водорода и проращивали без освещения в термостате при 25 0С как в стерильных условиях (в экспериментах по получению полисомных мРНК) на песке, так и без поддерживания строгих условий стерильности в рулонах фильтровальной бумаги, смоченной дистиллированной водой. Растения подсолнечника выращивали в условиях вегетационного опыта в 15- килограммовых сосудах с темно- серой оподзоленной почвой при естественных условиях освещения.
II. Сахарная свёкла (Beta vulgaris L.) сорта Белоцерковская односемянная- 45 (БЦО 45):
- корни, а также - гипокотили с семядолями (иначе стебли) 6- дневных этиолированных проростков,
- 7- и 8-е листья и корнеплоды в разные периоды онтогенеза сахарной свёклы.
Семена сахарной свёклы после стерилизации в 30 %-м пероксиде водорода проращивали в рулонах фильтровальной бумаги, смоченной дистиллированной водой, в термостате в темноте при 25 0С. Растения сахарной свёклы выращивали в 15-килограммовых сосудах с темно- серой оподзоленной почвой с внесением питательной смеси и одноразовой подкормкой в середине вегетации нитроаммофоской (5 г на сосуд).
2.2 Методы исследования
Для определения общего количества разных генов, которые экспрессируются в процессе морфогенеза вегетативных органов подсолнечника, и их регуляции на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях использовали методологию, разработанную в лаборатории Э. Дэвидсона и Р.Бриттена [94, 197]. Суть её состоит в определении представленных в единичных копиях последовательностей ДНК, с которых транскрибируются мРНК, являющиеся матрицами для синтеза полипептидов в цитоплазме клеток эукариот на определенных этапах их индивидуального развития. В соответствии с этой методологией, ключевым моментом которой является молекулярная ДНК: РНК гибридизация, для подсолнечника разработана и модифицирована система методов, включающая выделение ДНК, выбор условий для изоляции уникальных последовательностей ДНК, в которых миниминизированы примеси повторяющихся элементов генома, мечение УП ДНК и отделение от этой фракции ДНК обращённых повторов, разделение УП ДНК по их способности образовывать гибридные дуплексы с РНК, выделение полисом, в которых отсутствуют ядерные примеси, изоляция полисомных РНК, выделение ядер и ядерной ДНК, проведение молекулярной гибридизации меченых УП ДНК с избыточными количествами немеченых полисомных РНК и ядерных РНК.
2.2.1 Выделение ДНК
Способ 1. ДНК выделяли из этиолированных проростков подсолнечника по разработанной нами ранее методике, комбинирующей отдельные этапы модифицированного метода Дж. Мармура и мочевинно-фосфатного метода Бриттена и описанной в работе [198].
1 этап. Замороженный жидким азотом растительный материал тщательно растирали и заливали буфером, содержащим 1М SSC (0.15 М NaCl, 0.015 М цитрат натрия, рН 7.0), 0.1 М Трис-HCl, рН 8.4, 0.1 М ЭДТА, 0.1 М аскорбиновую кислоту, 0.3 М парааминосалициловую кислоту и 2 - 5 % ДСН. Соотношение объёмов растительного материала и лизирующего буфера составляло 1:2.
2 этап. Температуру гомогенной суспензии постепенно повышали до 60 0С, добавляли NaCl до конечной концентрации 1 М, вновь повышали температуру и инкубировали при 70 0С в течение 5 минут, после чего центрифугировали 20 мин при 2 000 g.
3 этап. Надосадочную жидкость депротеинизировали смесью хлороформ: изоамиловый спирт (соотношение объёмов 24:1) в течение 40 минут и затем центрифугировали при тех же условиях. Нуклеиновые кислоты осаждали тремя объёмами этилового спирта. Все операции этого этапа проводили при 4 0С.
4 этап. Полученный после центрифугирования осадок суммарного препарата нуклеиновых кислот растворяли в 0.15 М NaCl при 4 0С, добавляли РНКазу А в концентрации 60 - 100 мкг/мл и инкубировали в течение 1 часа при 37 0С.
5 этап. В инкубационную среду вносили мочевину, натрий хлористый, фосфатный буфер, ДСН до конечных концентраций соответственно равных 8 М, 1 М, 0.03 М и 1 % и наслаивали на оксиапатит при 25 0С, предварительно частично фрагментируя нуклеиновые кислоты. Оксиапатит промывали сначала 10-20 объёмами относительно объёма оксиапатита 8 М мочевиной, содержащей 0.14 М ФБ, потом последовательно 0.12 М ФБ + 1 М NaCl и 0.12 М ФБ. Нативную ДНК элюировали 0.4 М ФБ. Раствор ДНК диализировали сначала против 0.3 М натрий ацетата, содержащего 0.001 М ЭДТА, затем 0.3 М натрий ацетата (соотношение объёмов ДНК и диализного буфера 1:200), а потом переосаждали тремя объёмами этилового спирта. Препараты ДНК характеризовали по спектральным показателям и по кривым термической денатурации. Выделенным таким способом препаратам ДНК был свойственен высокий гиперхромным эффект, который составлял 38-39 %, и они удовлетворяли критериям чистоты, необходимым для проведения молекулярной ДНК: РНК гибридизации.
Способ 2. Для получения высокомолекулярной ДНК побегов и корней этиолированных проростков и зелёных листьев подсолнечника, а также сахарной свёклы использовали существенно модифицированный нами метод Деллапорта, описанный в работе [199].
Этап 1. Растительные ткани замораживали жидким азотом в предварительно охлаждённой жидким азотом ступке. Когда азот почти полностью испарялся, добавляли 5-6 % Polyclar AT (водо-нерастворимый поливинилпирралидон) для связывания полифенолов. Затем добавляли буфер для экстракции, содержащей 0.1 М Tрис-НСl, рН 8.2, 0.05 М ЭДТА, 0.5 М NaCl, 0.1 М аскорбиновую кислоту, 5 % парааминосалициловую кислоту, 1 % ?-меркаптоэтанол и 1 % диэтилдитиокарбомат (3 мл
- Киев+380960830922