РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методика дослідження електрогенезу та скорочення ізольованих гладеньком'язових смужок за допомогою модифікованого одинарного сахарного містка
Для дослідження змін мембранного потенціалу спокою, електротонічих потенціалів, гальмівних та збуджуючих синаптичних потенціалів під дією біологічно активних речовин використовували метод модифікованого одинарного сахарозного містка, розроблений Д.П. Артеменко, В.А. Бурим, І.В. Володимировою, М.Ф. Шубою [297]. Перевагою цього методу у порівнянні з методом подвійних сахарозних містків (модифікація Бергера та Барра) [298] є можливість реєстрації синаптичних потенціалів, які виникають у відповідь на подразнення імпульсами електричного струму інтрамурального нервового плетива в ГМС . В умовах подвійних сахарозних містків подразнення останніх є неефективним із тієї причини, що нервові волокна, які знаходяться у розчині сахарози, нездатні до збудження з причини відсутності Nа+ в оточуючому середовищі. Концентрація цих катіонів поступово починає збільшуватись у напрямку від межі сахарозних проміжків до центру тестової ділянки. У відповідності з кабельною теорією, щільність подразнюючого струму зменшується по довжині гладеньком'язової смужки експоненційно. Постійна довжини (?) для безм'якотних нервових волокон пропорційна квадратному кореню з їх діаметра (d). Враховуючи, що d міжварікозних ділянок інтрамурального нервового плетива становить 0,1 мкм, приблизна оцінка константи довжини (?) для них дає величину 0,1 - 0,3 мкм, що на порядок менше, ніж для м'язових клітин. Внаслідок малої величини ? подразнюючий струм різко зменшується по довжині нервових волокон. У результаті, в тому місці, де нервові волокна відновлюють свою збудливість, щільність подразнюючого струму є недостатньою для їх подразнення. Метод модифікованого одинарного сахарозного містка не передбачає використання сахарозної ізоляції між подразнюючими електродами (рис. 2.1) і тим самим немає вказаного недоліку. Як видно з рис. 2.1, кінець м'язової смужки m, який знаходиться у тестовій ділянці, втягували в зігнуту під прямим кутом поліетиленову трубку t, заповнену розчином Кребса. Подразнюючий струм від електронного стимулятора ЕСУ-2 (4) подавали через хлоровані срібляні електроди. Один із цих електродів
Рис. 2.1. Схематичне зображення пристрою модифікованого одинарного сахарозного містка [297] та блок-схема установки, до якої його було підключено:
m - м'язова смужка, розділена резиновими перегородками на три ділянки: Т - тест, S - сахарозна, КСl-на - з ізотонічним розчином КСl; t - поліетиленова трубка, в яку затягували кінець м'язової смужки m; f - тяга, за допомогою якої препарат з'єднували з пристроєм дозованого натяжіння та штоком електромеханічного перетворювача (1); 2 - підсилювач; 3 - реєструючий пристрій (електричний потенціометр КСП-4) (прилад N 1); А,С та В,D - відповідно хлоровані срібляні електроди подразнення та відведення*; 4 - електричний стимулятор універсальний (ЕСУ-2); 5 - підсилювач; 6 - реєструючий пристрій (електричний потенціометр КСП-4 (прилад N 2); 7 - осцилограф С1-18.
Примітка. * - для ліквідації артефакту подразнення, положення електрода С змінювали у межах тест-ділянки.розташовували у тестовій ділянці (електрод С), а другий (електрод А) - з'єднували з розчином, який заповнює поліетиленову трубку. Внаслідок великої провідності розчину Кребса, значна частина підведеного струму протікає по міжклітинному простору, а також через щілину між м'язовою смужкою та поліетиленовою трубкою. Цей струм не приймає участі у поляризації мембрани клітин та нервових волокон, які знаходяться в ГМС. Шунтуючу дію щілини ефективно зменшували шляхом вибору діаметра трубочки, а також змащування її основи мінеральним маслом. Електроди В та D приєднували до підсилювача (5). Для ліквідації артефакту подразнення, положення електрода С змінювали у межах тест-ділянки. Підсилювач (один із варіантів було зроблено та реалізовано в експерименті автором [299]) забезпечував вхідний опір 100 Мом, коефіцієнт передачі К = 1 ? 1000, вхідну ємність 4 пф, смугу частот до 1 Мгц, вихідний опір 700 Ом. Підсилювач у реєструючій схемі установки використовувався як вхідний високоомний прилад. Струм для живлення підсилювача становив 7 - 8 мА. Невеликі розміри підсилювача (схема легко реалізується на печатній платі розміром 15 ? 30 мм) дозволяли розташовувати його у безпосередній близькості від об'єкта досліджень .
Електротонічний потенціал викликали дією на гладеньком'язові смужки поляризуючого струму амплітудою 10-7 А. Інтрамуральне нервове плетиво подразнювали прямокутними імпульсами електричного струму (1?10-5 А), тривалість яких становила 0,2 - 0,5 мс.
Реєстрацію електричних потенціалів гладеньком'язових смужок здійснювали за допомогою електричного потенціометра КСП-4 (на рис. 2.1 прилад N 2) (6) на діаграмному папері. Візуальний контроль здійснювали додатково також з екрана осцилографа С1-18 (7).
Робоча камера модифікованого одинарного сахарозного містка термостатувалась від термостата УТ-15. Реєстрацію температури фізіологічного розчину здійснювали за допомогою електричного термометра ТПЕМ-1.
Для дослідження механічної активності гладеньком'язових смужок використовували пропорційний електромеханічний перетворювач (1), зв'язаний з об'єктом спеціальною тягою f (рис. 2.1). В якості перетворювача використовували механотрон 6МХ-1С, включений за мостовою схемою. Величина опору підбиралась таким чином, щоб забезпечити режим роботи (паспорт до механотрона 6МХ-1С) в області пропорційності. Дослідження скорочення - розслаблення, викликане гіперкалієвим розчином чи розчином, до складу якого входив агоніст, наприклад, ацетилхолін, здійснювали в ізометричному режимі при їх оптимальній довжині. Препарати розтягували до такої міри, при якій проявлявся максимальний ефект речовини, яка індукувала скорочення. Електричні сигнали з електромеханічного перетворювача подавали на вхід підсилювача (2), із виходу якого сигнали