РОЗДІЛ 2
ПОЛІМЕРНІ НОСІЇ ДЛЯ ТВЕРДО ФАЗНОГО СИНТЕЗУ ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ
Ключовим етапом синтезу олігонуклеотидних кон’югатів є власне синтез
олігонуклеотидної послідовності. Успіх твердофазного синтезу залежить від
правильного вибору стратегії синтезу та методу очистки олігомерів після
деблокування та відщеплення від носія. Однією з найважливіших проблем
олігонуклеотидного синтезу є вибір ефективного полімерного носія. Ключовими
факторами тут є розмір та гомогенність частинок полімера, середній діаметр пор,
механічна міцність, хімічна стійкість в процесі олігонуклеотидного синтезу, а
також довжина та структура лінкерної групи між полімером та олігонуклеотидом.
Історично перші носії для олігонуклеотидного синтезу були побудовані на основі
полімерів, що в тій чи іншій мірі набухають в органічних розчинниках -
полістиролу [330], целюлози [331] та поліамідних смол [19]. Такі синтетичні та
природні полімери легко функціоналізуються і забезпечують значний рівень
посадки нуклеозидів. Проте сьогодні вони використовуються досить рідко,
оскільки недостатньо ефективні внаслідок низької механічної міцності,
надлишкового набухання полімерів, незворотної адсорбції реагентів та низьких
виходів реакцій конденсації. Досить складно добитись і повного відмивання
реагентів від таких полімерів у процесі твердофазного синтезу. Цих недоліків
можна уникнути при використанні твердих і жорстких пористих неорганічних
полімерів, які хімічно стійкі та не набухають в органічних розчинниках. На
даний момент найширше застосовуються носії силікатної природи на основі
пористого скла CPG [26, 332, 334] і силікагелю [334-338].
Силікагелеві носії механічно стабільні, хімічно інертні в умовах
олігонуклеотидного синтезу, легко відмиваються і функціоналізуються, добре
поєднуються з будь-яким методом олігонуклеотидного синтезу. Функціональні групи
на поверхні силікагелю легко доступні для реагентів, незалежно від розчинника.
Для одержання таких носіїв використовують в основному дорогі силікагелі для
ВЕРХ типу “Porasil”, “Fractosil”, “Vydac” та ін.; непогані результати
демонструють і носії на основі силікагелю “Силохром С-80” [339].
В даній роботі запропоновано нові високоефективні носії для синтезу як
природних, так і модифікованих олігонуклеотидів на основі легкодоступного
вітчизняного мікросферичного аеросилогелю “Cилохром-2” з синтетичними
поліамідними лінкерними групами.
2.1. Синтез полімерних носіїв на основі мікросферичного силікагелю “Силохром-2”
Мікросферичний аеросилогель “Силохром-2”, відомий як носій для газової
хроматографії, за фізичними параметрам близький до спеціальних крупнопористих
силікатних носіїв для твердофазного олігонуклеотидного синтезу (Табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Фізичні параметри деяких силікатних носіїв
для твердофазного синтезу олігонуклеотидів
Носій
Розмір частинок, мкм
Питома площа поверхні, м2/г
Середній діаметр пор, нм
“CPG-500”
“Fractosil-500”
“Силохром С-80”
“Силохром-2”
125-177
63-125
200-300
150-250
70
50
70-100
40-60
50
50
40-60
60-90
Перевагою “Силохрому-2” порівняно з широко відомим силікагелем “Силохром С-80”
є правильна сферична форма частинок та більший діаметр пор, що, як відомо,
підвищує ефективність синтезу [332, 335, 338, 339]. Діаметр пор даного носія
(600-900Е) перевищує діаметр пор скла CPG-500 і наближається за цим параметром
до скла CPG-1000 (1000Е), яке вважається оптимальним носієм для
олігонуклеотидного синтезу. “Силохром-2” механічно достатньо міцний і тому з
успіхом може застосовуватися в автоматичних синтезаторах.
Ефективність носія для твердофазного синтезу залежить від ряду чинників, серед
яких ємність, діаметр пор, концентрація вільних силанольних груп, наявність і
природа лінкерної групи та ін. [332, 335-339]. Виходи реакцій конденсації
пов'язані зі стеричними параметрами – концентрацією функціональних груп на
поверхні полімеру та легкістю доступу реагентів до них. Ефективність синтезу
підвищується з ростом діаметру пор, оскільки це полегшує доступ реагентів до
олігонуклеотидного ланцюга, який синтезують на полімері [338]. Крім того,
ефективний полімерний носій для олігонуклеотидного синтезу повинен містити
відносно довгий лінкер (спейсер) між поверхнею полімера та приєднаним
нуклеозидом для досягнення високих виходів реакцій конденсації. Збільшення
відстані між носієм та олігонуклеотидним ланцюгом значно підвищує виходи
синтетичних олігонуклеотидів. Запропонований цілий ряд конструкцій лінкерних
груп, в основному поліамідної природи (Табл. 2.2).
Вища ефективність носіїв зі спейсерами пояснюється зменшенням нековалентної
взаємодії між нуклеозидами та поверхнею полімеру та усуненням стеричних перепон
для приєднання мономерів, особливо на перших стадіях синтезу (далі роль
спейсера може відігравати зростаючий олігонуклеотидний ланцюг). Ефективність
синтезу олігонуклеотидів залежить як від довжини лінкерної групи, так і від її
хімічної структури [336-340]. Кращі результати (вихід і гомогенність цільових
олігонуклеотидів) досягаються із відносно жорсткими лінкерами, що знаходяться у
витягнутій конформації, в результаті чого нуклеозидні залишки виявляються
достатньо віддаленими від поверхні полімера, що забезпечує вільний доступ
реагентів до зростаючого олігонуклеотидного ланцюга. Навпаки, зростання
внутрімолекулярних водневих зв'язків і диполь-дипольних взаємодій збільшує
вірогідність зігнутих конформацій і знижує вихід продуктів олігонуклеотидного
синтезу [337, 338]. Присутність ароматичних фрагментів у складі лінкера
погіршує ефективність синтезу, оскільки в цьому випадку можливі небажані
гідроф
- Киев+380960830922