<p style="font-family: 'Times New Roman', 'Times', serif; font-size: 18px; background-color: #ffffff;"><span style="background-color: #ffffff;">РАЗДЕЛ 2<br />МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ<br />2.1. Растительный материал<br /> Материалом для анализа послужили инбердные линии подсолнечника селекции Института растениеводства им. В.Я. Юрьева.<br /> Для выявления возможной внутрилинейной гетерогенности анализировали не менее 30 семян по каждой линии.<br /> Каждая линия, участвующая в скрещиваниях проверялась на однородность. По каждой линии исследовалось 100 семян. <br /> Для изучения генетического контороля изоферментов анодной эстеразы, катодной эстеразы, катодной кислой фосфатазы и НАД-зависимой малатдегидрогеназы в сухих семенах использовали популяции F2: Сх2552хХ982 (скрещивание 1), Сх2552хХ854 (скрещивание 2) и Сх2552хХ790 (скрещивание 3).<br /> Генетический контроль листовой анодной эстеразы и катодной эстеразы изучали в популяции F2 от скрещивания двух инбредных линий Сх2552 и Х982. <br /> Семена F2 получали следующим образом: гибриды F1 создавали путем скрещивания стерильного аналога - Сх2552 (материнский компонент) с восстановителями фертильности - Х982, Х854 и Х790 (отцовский компонент). В результате самоопыления гибридов F1 получали семена F2. <br /> По каждой гибридной комбинации F2 было проанализировано следующие количество семян: скрещивание 1 - 96, скрещивание 2 - 33, скрещивание 3 - 107. Для установления генетического контроля листовой анодной и катодной эстеразы анализировали 160 растений F2. <br /> Для определения процента гибридности семян F1 использовали 6 гибридов селекции Института растениеводства им.В.Я.Юрьева. Гибридные семена были предоставлены опытными хозяйствами Харьковской области. По каждой гибридной комбинации анализировали не менее 100 семян. <br /> Для биохимической паспортизации, классификации исходного материала использовали коллекцию из 46 и 79 инбредных линий подсолнечника селекции Института растениеводства им. В.Я.Юрьева, соответственно. <br /> <br /> 2.2. Подготовка проб для электрофореза ферментов<br /> Экстракцию ферментов проводили из отдельных семян и свежей растительной (листовой) ткани 0,02 М Трис-HCl буфером (pH 7,5), содержащим 0,01мМ PVP; 0,006мМ ЭДТА; 0,1 мМ ДТТ и 20% сахарозу на холоде в течение 1 часа. <br /> Экстракты ферментов сразу же использовали для электрофореза.<br /> <br /> 2.3. Электрофорез ферментов в полиакриламидном геле<br /> <br /> Для разделения изоферментов анодной эстеразы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, лейцинаминопептидазы, НАД-зависимой малатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы использовали Трис-ЭДТА-боратную буферную систему - 0,09М Трис; 0,09М H3BO3; 0,0031М ЭДТА (pH 8,3). Концентрация акриламида и метиленбисакриламида в разделяющем геле составила 7% и 0,37%, соответственно.<br /> Для электрофореза ферментов изоцитратдегидрогеназа, анодная кислая фосфатаза, алкогольдегидрогеназа и малатдегидрогеназа (НАДФ) использовали Трис-глициновую буферную систему - 0,009М Трис; 0,06М глицина (pH 8,9). Концентрация акриламида составила 7%, а метиленбисакриламида - 0,34%.<br /> Электрофорез проводили при постоянном напряжении (300 V) в течение 2,5 часов. <br /> Для разделения изоферментов катодной эстеразы и катодной кислой фосфатазы использовали алюминий-лактат буферную систему - 0,035М алюминий лактата. <br /> Концентрирующий гель содержал 5% акриламида, 0,5% метиленбисакриламида и разделяющий гель содержал 7% акриламида, 0,34% метиленбисакриламида.<br /> Электрофорез катодной эстеразы и катодной кислой фосфатазы проводили в течение 3 часов при постоянном напряжении 250 V.<br /> В качестве катализатора и инициатора реакции полимерезации использовали N'N'N'N' - тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) и перосульфат аммония.<br /> <br /> 2.4. Гистохимическое окрашивание гелей<br /> Гистохимическое окрашивание гелей проводили по Шоу и Прассад с модификациями [189]. Для выявления активности ферментов в гелях использовали следующие методы окраски:<br />1) Анодная и катодная эстераза:<br />100 мл 0,1М фосфатный буфер (pH 6,0)<br />30 мг ?-нафтилацетат и ?-нафтилацетат растворяли в 1 мл ацетона. 100 мг прочного синего РР. <br />2) Анодная и катодная кислая фосфатаза:<br />100 мл 0,1 М ацетатного буфера (pH 5,5); 30 мг ?-нафтилфосфат и ?-нафтилфосфат; 70 мг MgCl2, 70 мг прочного синего К.<br />3) Малатдегидрогеназа (НАД):<br />100 мл 0,1М Трис-HCl (pH 8,0); 20 мл 0,5М малат Na (pH 6,0); 40 мг MgCl2, 30мг НАД; 30 мг МТТ, 4 мг ФМС.<br />4) Малатдегидрогеназа (НАДФ):<br />100 мл 0,1М Трис-HCl (pH 7,0); 20 мл 0,5М малат Na (pH 6,0); 40 мг MgCl2, 30 мг НАДФ; 30 мг МТТ, 4 мг ФМС.<br />5) Лейцинаминопептидаза:<br />100 мл 0,1М фосфатного буфера (pH 6,0); 40 мг ?-лейцин-?-нафтиламид; 60 мг черный К соль.<br />6) 6-фосфоглюконатдегидрогеназа:<br />100 мл 0,1М Трис-HCl буфер (pH 8,0); 30 мг 6-фосфоглюконовая кислота; 20 мг MgCl2; 10 мг НАДФ; 20 мг МТТ; 4мг ФМС.<br />7) Изоцитратдегидрогеназа:<br />100 мл 0,1М Трис-HCl (pH 8,0); 15 мг D,L-изоцитрат натрия, 15 мг НАДФ, 5мг МТТ, 4мг ФМС.<br />8) Алкогольдегидрогеназа:<br />100 мл Трис-HCl буфер (pH 8,0), 10 мг НАД, 10 мг МТТ, 4 мг ФМС, 1мл 96%-ного этанола.<br />9) Аспартатаминотрансфераза:<br />100 мл Трис-HCl буфер (pH 8,0), 100 мг аспарагиновая кислота, 12 мг ?-кетоглутаровая кислота, 150 мг прочный синий В соль.<br /> <br /> 2.5. Выделение ДНК<br /> <br /> ДНК выделяли из 6-10 зрелых семян экстрагирующим буфером, содержавшим 0,1М Трис-HCl (pH 8,0), 0,5M NaCl, 500мM Na2EDTA, 1,25% SDS и 0,38% бисульфата натрия [190]. Экстракцию проводили на водяной бане при 650 С в течение 45 мин, периодически помешивая. Депротеинизацию проводили смесью хлороформ/изоамиловый спирт в соотношении 24:1. После центрифугирования при 4000 об/мин в течение 15 мин водную фазу (верхний слой) переносили в чистые пробирки. ДНК осаждали 95%-ным охлажденным этиловым спиртом и центрифугировали при 4000 об/мин. Осадок тщательно промывали в 70%-ном этаноле и высушивали при комнатной температуре. Подсушенный осадок растворяли в 200 мкл бидистилированной воды. Концентрацию ДНК определяли с использованием калибровочной кривой, созданной на основе полос с известным содержанием ДНК (программа "Quantity One").<br /> <br />2.6. Условия амплификации<br /> <br /> Амплификацию проводили в 30 мкл буферн</span></p>
- Київ+380960830922