ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты и материалы исследований
Эксперименты проводили на половозрелых мышах F1 (СВА х Black), весом около 18
- 20 г, и крысах линии Вистар, общим количеством не менее 700 животных. В ряде
опытов использовали крыс трех возрастных групп: молодых - отъемышей (2-3 нед.),
взрослых - половозрелых (3-4 мес.), старых (24-26 мес.). Животных содержали на
стандартном рационе [49] в условиях экспериментально - биологической клиники,
за сутки до опыта их прекращали кормить, но продолжали поить водой.
Изучение действия витаминов, их комплексов и производных, а также других
соединений на биохимические процессы и показатели проводили in vivo
(внутримышечные или внутрибрюшинные инъекции) в гомогенатах печени, почек,
мозга и сердца.
2.2. Методы исследований
Поскольку темой нашей работы является изучение судьбы и роли витамина РР в
организме, то нами выбран быстрый, доступный для массовых определений и не
требующий дорогостоящих реактивов метод определения окисленных и
восстановленных форм НАм-коферментов, причем с внутренним и внешним стандартом
[108, 161].
Выбор ферментов ЛДГ и Г-6-Ф-ДГ объясняется, во-первых, их зависимостью от
никотинамидных коферментов, во-вторых, их важной ролью в энергетическом обмене
и различным положением в нем [93, 186].
2.2.1. Метод определения окисленных и восстановленных форм никотинамидных
коферментов в тканях.
Принцип метода заключается в измерении интенсивности флуоресценции
никотинамидных коферментов, развивающейся после добавления к кислотным и
щелочным экстрактам тканей ацетона.
Все реактивы готовили на бидистиллированой воде непосредственно перед опытом и
хранили в холодильнике.
Приготовление кислых экстрактов. Сразу после декапитации из животного
извлекали ткани и клали их на лед. Из каждой ткани брали по две навески (по 0,5
г). Одну из них тщательно растирали в ступке, добавляя понемногу заранее
приготовленный и охлажденный 2,5 %-ный раствор (10 мл) ТХУ. Содержимое ступок
выливали в центрифужные пробирки и оставляли для лучшего экстрагирования
окисленных НАм-коферментов на 10-15 мин. при периодическом перемешивании. После
центрифугирования (15-20 мин.) при 2-3 тыс. об/мин. экстракт сливали. Аликвоты
его обрабатывали для флуориметрического определения суммы НАД+ и НАДФ+.
Приготовление щелочных экстрактов. Другую навеску тканей (0,5 г) кипятили в
пробирке в присутствии 5 мл 0,1 N NаОН в течение одной минуты для
предотвращения разрушения НАД(Ф)Н+Н+, после чего ткани растирали в ступке со
стеклянным пестиком. Содержимое ступки количественно переносили в центрифужную
пробирку, в которую добавляли по 1 мл 0,1М фосфатного буфера (рН 7,2) и 4 мл
воды. Для доведения рН раствора до 8-8,5 добавляли 2-3 капли 6 N НCl.
Содержимое пробирки перемешивали в течение 15 мин для лучшей экстракции
НАД(Ф)Н+Н+, а затем центрифугировали и аликвоты брали для флуориметрического
определения суммы НАД(Ф)Н+Н+. Обработка экстрактов для флуориметрического
определения. Источником окисленных никотинамидных коферментов служили кислые, а
восстановленных - щелочные экстракты. Учитывая различную концентрацию в них
НАм-коферментов, брали определенные объемы кислых и щелочных экстрактов. Для
печени, почек и сердца брали по 0,2 мл экстракта, для мозга - 0,5 мл. В каждой
пробирке объем экстракта доводили водой до 1 мл. Туда же добавляли по 0,5 мл
перегнанного нефлуоресцирующего ацетона и сразу по 0.2 мл 6 N NаОН. Пробы
оставляли на 5 мин, периодически тщательно перемешивая. Затем в пробирки
добавляли по 0,3 мл 6 N HСl, закрывали стеклянными колпачками и выдерживали на
кипящей водяной бане в течение 2 мин. После охлаждения в каждую пробирку
приливали по 0,5 мл 20%-ного раствора КН2РО4 и 7,5 мл воды. Таким образом,
конечный объем пробы составлял 10 мл, а рН среды при этом находился в пределах
(рН 2- 4). Пробы устойчивых соединений конденсации НАм-коферментов с ацетоном
флуореметрировали против стандарта на флуориметре ЭФ -3МА. Измерение проводили
против стандарта, содержащего 5 мкг N1-метил-НАм (внешний стандарт). Согласно
рекомендациям Коденцовой [108], для более точного определения никотинамидных
коферментов использовали внутренний стандарт (добавляли N1-метил-НАм к
гомогенату), контроль (содержащий экстракты и не содержащий ацетон) и контроль
к внешнему стандарту (не содержащий экстракта).
Содержание никотинамидных коферментов (Х) в (мкг/г ткани) рассчитывали по
формуле (2.1):
(мкг/г ткани), (2.1)
где Е - флуоресценция пробы;
2,5 - коэффициент, учитывающий различия в степени флуоресценции N1-метил-НАм и
никотинамидных коферментов;
Ест - флуоресценция стандарта;
R - масса навески в экстракте (г).
Содержание НАм-коферментов в кислых экстрактах соответствовало сумме НАД+ и
НАДФ+, а в щелочных экстрактах - сумме НАДН и НАДФН.
2.2.2. Метод определения активности глюкозо-6-фосфатдегидгрогеназы.
Определение активности Г-6-Ф-ДГ производилось при комнатной температуре.
Получение растворимой фракции осуществляли в солевом буфере, состоящем из 0,15
М KCl и 0,02 М КНСО2, рН 7,5.
Все реактивы готовили на бидистиллированой воде непосредственно перед опытом и
хранили в холодильнике.
Реактивы: 0,1 М MgCl2; 0,01 М буфер-трис HCl, рН 7,6; 0,05 М 6-фосфоглюконат
(натриевая соль); 0,025 М НАДФ+.
Инкубационная cреда (общий объем 3,3 мл) содержала следующие компоненты в
мкмолях: НАДФ+ - 2,5; Буфер трис-НСl рН 7,6 - 5,0; MgCl2 - 50,0
глюкозо-6-фосфат - 5,0.
Ход определения. В кювету спектрофотометра СФ-46 наливали 2,8 мл инкубационной
cреды, не содержащей НАДФ, и 0,1 мл гомогената, перемешивал
- Київ+380960830922