Розділ 2
2. Матеріал і методи досліджень.
Експериментальна частина роботи виконана на курях яєчного кросу “Tetra-SL” 30-,
60-, 120-, 180- і 300-денного віку (дослід 1), які вирощувалися в умовах
птахофабрики “Львівська” (с. Заводське, Буського району, Львівської області) і
на курях вказаної породи 300-денного віку в умовах віварію Інституту біології
тварин УААН (дослід ІІ) в 1999-2000 роках. У першому досліді кури утримувалися
в стандартному приміщенні з регульованим мікрокліматом, у другому досліді – в
умовах віварію інституту з нерегульованим мікрокліматом. Дослідна птиця в
першому досліді отримувала комбікорми № РК 2-6, № РК 3-4 і № РК 4-4, в другому
досліді – комбікорм № РК-18, які забезпечували її потребу в усіх елементах
живлення згідно норми.
2.1. Дослідження вікових особливостей обміну білків в органах і тканинах курей.
У першому досліді досліджували загальний вміст білків, їх амінокислотний склад
і співвідношення окремих фракцій, інтенсивність синтезу білків в умовах in
vitro, активність кислих і лужних протеаз, аланін- і аспартатамінотрансфераз у
печінці, грудному м’язі, шкірі і слизовій оболонці порожньої кишки курей в 30-,
60-, 120-, 180- і 300-денному віці. Крім цього, досліджували інтенсивність
синтезу білків у вказаних органах і тканинах курей в умовах in vitro при
додаванні до інкубаційного середовища лізину, глюкози і пальмітинової кислоти в
кількості відповідно 1,7; 1,6 і 4 мкмоль. В окремому досліді досліджували
метаболізм [2-14C]лізину, [2-14C]цистину і 3-феніл-[1-14C] аланіну у вказаних
органах і тканинах 300-денних курей.
Зразки органів і тканин одержували через 3-5 хвилин після забою курей, який
проводили шляхом декапітації, обмивали їх охолодженим фізіологічним розчином і
підсушували фільтрувальним папером. Частину зразків тканин відразу
використовували для дослідження синтетичних і енергетичних процесів та
активності ферментів у них, а частину зразків тканин, які використовували для
дослідження вмісту білків, їх амінокислотного складу і співвідношення окремих
білкових фракцій – заморожували в рідкому азоті.
2.1.1. Визначення загального вмісту білків в органах і тканинах курей.
Загальний вміст білків у тканинах курей визначали за методом К’єльдаля [67],
який базується на здатності органічних сполук при дії сірчанової кислоти при
кип’ятінні окиснюватися до СО2 і Н2О. Азот білкових і інших сполук при цьому
відщеплюється і перетворюється в NH4+. Кількість аміаку визначають шляхом
титрування 0,01н розчином NaOН і шляхом множення одержаних даних на коефіцієнт
6,38 визначають кількість білку.
2.1.2. Визначення співвідношення окремих фракцій білків в органах і тканинах
курей.
Співвідношення окремих білкових фракцій в органах і тканинах курей досліджували
методом електрофорезу в гелі агар-агару у подвійному веронал-мединаловому
буфері (pH-8,6) [38]. Фіксували електрофореграми 2% розчином оцтової кислоти,
після чого фарбували їх 0,1% амідочорним і відмивали 2% розчином оцтової
кислоти, який містив 2% гліцерину. Визначення співвідношення окремих білкових
фракцій проводили на денситометрі.
2.1.3. Визначення вмісту окремих амінокислот у білках органів і тканин курей.
Амінокислотний склад білків досліджуваних органів і тканин курей визначали на
автоматичному аналізаторі амінокислот – ААА Т339, в основі дії якого лежить
принцип іонообмінної хроматографії. Тканинні білки гідролізували 6н розчином
соляної кислоти при температурі 1100С протягом 24-х годин [67].
2.1.4. Визначення активності аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази
в органах і тканинах курей.
Активність вказаних ферментів визначали за допомогою набору реактивів
“Аспартатамінотрансферази” і “ Аланінамінотрансферази” фірми “Simko Ltd” [90].
Принцип методу полягає в тому, що внаслідок переамінування при дії
аспартатамінотрансферази утворюється глутамінова і піровиноградна кислоти, а
при дії аланінамінотрансферази – щавлева і піровиноградна кислоти. При
додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється
забарвлений гідразон піровиноградної кислоти. Інтенсивність забарвлення
визначається шляхом колориметрії на КФК-3 при довжині хвилі 530 нм. Активність
ферментів визначали за калібрувальним графіком і виражали в мкмоль
піровиноградної кислоти на г тканини за одну хвилину.
2.1.5. Визначення активності протеаз в органах і тканинах курей.
Активність кислих і нейтральних протеаз визначали за ступенем гідролізу
відповідно казеїну і гемоглобіну гомогенатами органів і тканин при інкубації їх
протягом відповідно 60- і 30-ти хвилин при pH-7,0 i 3,0 з наступним визначенням
кількості звільненого казеїну на спектрофотометрі СФ-16 при довжині хвилі 280
нм [14].
2.1.6. Дослідження інтенсивності синтезу білків в органах і тканинах курей в
умовах in vitro.
Інтенсивність синтезу білків в органах і тканинах курей визначали шляхом
інкубації зрізів тканин розміром приблизно 1x1x1 мм у фосфатному буфері
Кребс-Рінгера (pH-7,4, відношення маси тканини до об’єму буферу – 1:10), до
якого додавали 1 мкКюрі [2-14C]лізину, протягом 60-ти хвилин при температурі 37
0С [22,74]. Утворений в процесі інкубації зрізів тканин з [2-14C] лізином СО2
вловлювали 20% розчином NaOH [22] і визначали його радіоактивність на рідинному
сцинтиляційному лічильнику LKB (Швеція) у толуоловому сцинтиляторі. Після
закінчення інкубації ферментативні процеси зупиняли шляхом додавання до
інкубаційної суміші 10% трихлороцтової кислоти. Ліпіди зі зрізів тканин
екстрагували сумішшю хлороформ-метанол 2:1 (Folch, 1957) і визначали їх
радіоактивність на вказаному лічильнику після відгонки ліпідного екстракту.
Радіоактивність білків, синтезован
- Київ+380960830922