РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дані представлені в попередньому розділі свідчать про те, що цілий ряд питань деградації білків в травному тракті великої рогатої худоби з'ясовані недостатньо. Це стосується, в першу чергу, вікових особливостей протеолітичних процесів як в різних відділах шлунка, так і в кишках, фізико-хімічних особливостей протеїназ ,зв'язаних з різними фракціями вмісту рубця, їх регуляторних аспектів. Виходячи із вищесказаного наші дослідження були скеровані на вивчення:
- особливостей протеолітичних процесів у вмісті рубця і хімусі 12-палої кишки бичків протягом перших місяців після народження;
- впливу різних модуляторів (специфічних інгібіторів, катіонів, протекторів SH-груп, іонних детергентів, і т.д.), а також концентрації протонів водню на протеолітичну активність у вмісті рубця, окремих його фракцій та в хімусі 12-палої кишки бичків;
- деяких властивостей протеїназ зв'язаних з різними фракціями симбіотичних мікроорганізмів рубця бичків.
Експериментальна частина роботи виконана на 2-х групах поліфістульних (рубця і 12-палої кишки) бичків-аналогів чорно-рябої породи віком з 1-го до 6-ти місяців (по 6 голів в групі) в 1998-2000 роках у весняно-літний період в дослідному господарстві Інституту біології тварин УААН ("Чишки"). Тварин годували згідно встановлених норм. Утримання стійлове.
Накладання фістул на рубець і 12-палу кишку телят проводилось у 20-денному віці. Перед проведенням хірургічної операції тварини протягом 24 годин витримувались на голодній дієті. Для наркозу використовували 33%-ний розчин етилового спирту, який підігрівали до температури 38?С і вводили внутрішньовенно в кількості 200 мл на голову. На підготовленому операційному полі (вистригання шерсті, дезинфекція, стерильне полотно) проводили інфільтраційну анастезію 1%-ним розчином новокаїну. До операції приступали в стані повного наркозу тварини.
Фістулу на рубець теляти накладали в ділянці лівої "голодної" ямки після фіксації на операційному столі в лівосторонньому боковому положенні. Дуоденальну фістулу встановлювали на ділянці кишки нижче впадіння протоків підшлункової залози і печінки. Фістулу закріплювали між останнім і передостаннім ребрами.
За 10-12 днів до початку взяття матеріалу для біохімічних досліджень телята були розділені на дві групи - контрольну і дослідну.
Для біохімічних досліджень вміст рубця і хімус 12-палої кишки відбирали через 2 години після ранкової годівлі через фістули у 1-, 1,5-, 2- , 3-, 4-, 5- і 6-місячному віці тварин за допомогою приладу, виготовленого на основі колби Бунзена та вакуумної помпи Комовського [16]. Одержані зразки вмістимого рубця розділяли на окремі фракції (бактерії, інфузорії, кормові частинки, безклітинну рідину).
2.1. Окремі етапи досліджень
2.1.1.Фракціонування вмісту рубця телят. Для фракціонування зразки вмісту рубця телят зазначеного вище віку фільтрували через чотири шари марлі, а фільтрат центрифугували при 2000 g 10 хвилин. Одержаний надосад розділяли далі шляхом центрифугування при 20000 g 30 хвилин на безклітинну рідину (фракція 1) і бактерії (фракція 2). Осад з першого центрифугування розчиняли в початковому фільтраті і добавляли калій-фосфатний буфер при рН 7,0 з глюкозою, натрій ацетатом і магній сульфатом та інкубували на 250 мілілітровій ділильній воронці при температурі 38?С протягом 60 хвилин. Інфузорії у вигляді білого шару відбирали (фракція 3), а кормові частинки, які залишалися на поверхні, знімали (фракція 4). Проби 2- і 3-ої фракцій двічі промивали 0,05М тріс-НСl буфером (рН 7,2) з центрифугуванням при 20000 g протягом 10 хвилин і одержані в осаді клітини використовували в аналізах. Враховуючи, що протеолітичні ферменти можуть бути зв'язані з поверхнею клітин (позаклітинні протеїнази), або локалізовані в клітинах (клітинні протеїнази) фракції 2 і 3 (бактеріальну і інфузорну) використовували або без попереднього руйнування клітин, або з їх руйнуванням. Клітини руйнували на ультразвуковому дезінтеграторі УП-1 (Selmi). Безклітинний екстракт відділяли від незруйнованих клітин і клітинних решток центрифугуванням при 20000 оборотів на хвилину протягом 30 хвилин [2].
2.1.2.Розділення протеїназ окремих фракцій вмісту рубця. При розділенні протеїназ на першому етапі використовували нагрівання при температурі 50?С протягом 10 хвилин. Одержаний надосад після центрифугування при 3000 g протягом 10 хвилин солюбілізували 0,1%-ним розчином тритону Х-100 і наносили на колонку (1,5х40 см), наповнену сорбентом Toyopearl HB-55 і зрівноважену 0,025 М тріс-HCl буфером, рН 7,0. Елюцію білків проводили цим же буфером при швидкості току рідини 1 мл за хвилину і відбирали по 5 мл кожної фракції. (Протеази кормових частинок не розділяли, оскільки екстракція і гельфільтрація цієї фракції вимагала більш складної обробки матеріалу). Для дальших досліджень сусідні фракції елюатів з високою протеїназною активністю об'єднували в одну пробу.
Для калібрування колонки за молекулярними масами застосовували відомі білки - піруваткіназу - біля 400 кДа, лактатдегідрогеназу - 150 кДа, гексокіназу - 90 кДа, альбумін бичої сироватки - 60 кДа, РНК-азу - 40 кДа, інгібітор трипсину із сої - 21 кДа, інсулін - 6 кДа. Всі згадані препарати (крім інсуліну) виробництва фірми "Reanal".
Для дальшої очистки протеїнази (у випадку ферментів безклітинної рідини) одержану при гельфільтрації фракцію білків з відповідною молекулярною масою наносили на колонку (1,5Х15 см), заповнену іонообмінником DEAE-Toyopearl 650M, зрівноважену 0,025 М тріс-HCl буфером рН 7,0. Білки елюювали лінійним градіентом NaCl (0-0,6М NaCl) у вищеназваному тріс-HCl буфері при швидкості 0,5 мл/хв. Відбирали по 3 мл кожної фракції і визначали в них протеїназну активність.
2.1.3. Дослідження впливу інгібіторів, активаторів та інших модуляторів на активність протеїназ вмісту рубця та хімусу 12-палої кишки телят. В окремих варіантах досліджень при визначенні протеїназної активності в проби до інкубаційної суміші дода