<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ<br />2.1. Штами мікрорганізмів та плазміди<br /> Використані в роботі штами E.coli та актиноміцетів подано в табл.2.1. Як вектори для клонування ДНК та перенесення в штами актиноміцетів використали плазміди pSOK101, pSOK201, pCHZ101 [161], pWA1 [107], pSET152, pOJ260 [137], в E.coli - pUC18/19, pBluescript 2KS+/SK+ [134], pMun2 [148]. Характеристика цих векторів і сконструйованих на їхній основі плазмід подана в таблиці 2.2. Як тест-культуру під час визначення антибіотичної активності штамів S.globisporus та S.cyanogenus S136 використовували Streptomyces albus CEST113, продуцентів урдаміцинів Streptomyces fradiae Tu2717 та канаміцинів S.kanamyceticus 1 - Bacillus subtilis VKM428.<br />2.2. Середовища та реактиви<br /> 2.2.1. С е р е д о в и щ а т а у м о в и к у л ь т и в у в а н н я. Для вирощування штамів актиноміцетів використовували повноцінні середовища ВС [3] Беннета [71], КС, R2YE [18]. Для кількісного та якісного аналізу ландоміцинів, що продукуються S. globisporus 1912, S.cyanogenus S136 та їхніми мутантами, використовували рідке середовище SG (г/л: глюкоза - 20, соєвий пептон - 10, CaCO3 - 2, CoCl2 - 0,001, pH до стерилізації - 7,2). Для продукції урдаміцинів штами S.fradiae Tu2717, вирощували у рідкому середовищі NL111 [67]. Продукцію канаміцинів штамами S.kanamyceticus вивчали на середовищі ВС [2]. Міцелій для отримання протопластів, а також для виділення сумарної та плазмідної ДНК, вирощували у рідких середовищах YEME, TSB [71]. Регенерацію протопластів проводили на середовищі R2YE [18]. Для визначення антибіотичної активності штамів S.globisporus та S.fradiae Tu2717 використовували середовища R2YE та КС відповідно. Культуру S.albus вирощували на середовищі Беннета, B. subtilis на повноцінному середовищі АПА [18], E.coli - на L-агарі та в LB [71]. Кон'югаційні суміші E.coli -Streptomyces висівали на ВС. <br /> Культури актиноміцетів вирощували при температурі 30oC; штами E.coli та B. subtilis - при 370С. Для продукції ландоміцинів штамами S.globisporus 1912 та S.cyanogenus S136 суспензію клітин (титр 4,2-4,8?107) інокулювали в 50 мл середовища TSB і інкубували 24 год (250 об/хв). 24-годинну культуру інокулювали в основне середовище (SG; 4% від об'єму основної культури) і вирощували 48 год. З метою експрес-аналізу продукції ландоміцинів, штами S. globisporus інкубували 48 год в середовищі SG без вирощування попередньої культури. <br /> 2.2.2. Р е а к т и в и. Для приготування середовищ використовували: казамінові кислоти, пептон, триптон, дріжджовий екстракт фірми, екстракт LabLemco "Difco" (США); гліцин, агар, D-глюкозу та D-мальтозу виробництва фірми "Reanal" (Угорщина), соєвий пептон фірми "Merck" (США). <br /> У роботі використано антибіотики: хлорамфенікол фірми "Serva" (ФРН), еритроміцину фосфат, канаміцину сульфат комбінату "Синтез" (Курган, Росія), тетрацикліну гідрохлорид Пензенського заводу медпрепаратів (Росія), гентаміцину сульфат, ампіциліну натрієву сіль, стрептоміцину сульфат Київського заводу медпрепаратів, гігроміцину В ("Sigma", США), апраміцину сульфат, спектиноміцину сульфат ("Roth", ФРН). Хлорамфенікол та тетрациклін розчиняли у 50% етанолі, інші антибіотики - у дистильованій воді. Для вивчення спектрів стійкості до антибіотиків використовували паперові диски з антибіотиками виробництва "Ферейн" (Росія): олеандоміцином, еритроміцином, новобіоцином - 15 мкг/диск; левоміцетином (хлорамфеніколом), ристоміцином, канаміцином, мономіцином (паромоміцином), стрептоміцином, неоміцином, тетрацикліном - 30 мкг/диск; оксациліном, бензилпеніциліном, гентаміцином, лінкоміцином, ампіциліном - 10 мкг/диск; рифампіцином - 5 мкг/диск; поліміксином - 300 од./диск; карбеніциліном - 25 мкг/диск.<br /> Для отримання протопластів використовували лізоцим ("Roth", ФРН); для трансформації протопластів - поліетиленгліколь (ПЕГ) з молекулярною масою 1000 ("Roth",ФРН). Для екстракції полікетидів, подальшої тонкошарової хроматографії (ТШХ), високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) чи мас-спектрального аналізу методом MALDI-TOF використовували етилацетат, хлороформ, метанол, ацетонітрил, трифтороцтову кислоту та ?-ціано-4-гідроксициннамонову кислоту виробництва фірми "Merck" (США).<br /> В експериментах з виділення та аналізу сумарної ДНК використовували: етилендиамінтетраацетат (ЕДТА), метиленовий синій, бромід етидію, фенілметилсульфонілфлюорид, ацетат калію та ацетат натрію, N-[2-гідроксиетил]піперазин-N-[2-етансульфонову кислоту (HEPES-NaOH) ("Sigma", США), додецилсульфат-натрію (SDS), Tрис-HCl та Трис-амінометан ("Reanal", Угорщина); агарозу ("Sigma"США, "Chemapol", Чехія).<br /> Ферментативна обробка ДНК (гідроліз ДНК ендонуклеазами рестрикції, лігування, дефосфорилювання, обробка фрагментом Кленова та Т4-ДНК-полімеразою) проводилась із використанням ферментів та буферів, придбаних із стандартних комерційних джерел ("MBI Fermentas", Литва, "Promega", США, "Boehringer Mannheim", ФРН, "Invitrogen", США, "NEB", Великобританія). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили із використанням рекомбінантної Taq-полімерази ("Linus", США), PfuI-полімерази (Boeringer Manheim) та VENT-полімерази ("NEB", Великобританія), диметилсульфоксиду ("Merck", США) та мінеральної олії ("Sigma", США). Гібридизацію за Саузерном проводили з використанням набору "DIG DNA labeling and detection kit" ("Boehringer Mannheim",ФРН). Секвенування ДНК проводили із використанням набору "Cy5 AutoCycle Sequencing Kit" ("Pharmacia Biotech", Швеція). Очищені фрагменти ДНК та продукти ПЛР отримували із використанням наборів "QiaQuick Plasmid Purification Kit" ("Qiagen", США) та "Concert Rapid PCR Products Purification Kit " ("Difco", США), відповідно.<br /> <br />2.3. Методи<br /> 2.3.1. В и з н а ч е н н я р е з и с т е н т н о с т і ш т а м і в д о а н т и б і - о т и к і в. Спектр стійкості до антибіотиків визначали методом дифузії в агар з використанням дисків з антибіотиками. Диски накладали на верхній шар 0,7% агару МС або ВС з спорами або міцеліальними фрагментами культур. Виміри диаметр</p>
- Київ+380960830922