Вы здесь

Отримання трансгенних рослин яблуні шляхом генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens

Автор: 
Корховий Віталій Іванович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2005
Артикул:
0405U003856
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

<p>РОЗДІЛ 2<br /> МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ<br /> 2.1.Матеріали.<br /> 2.1.1.Рослинний матеріал. Для роботи використовували рослинний матеріал яблуні (Malus domestica Borkh.) зарубіжної та вітчизняної селекції, які представляють інтерес для сучасних селекційних програм. Були використані наступні сорти яблуні: Айдаред - отриманий шляхом схрещування сортів Вагнер і Джонатан, 1935 р., дослідна станція Айдахо (США); Голден Делішес - походить від сіянця, знайденого А.Х.Малінсом в 1890 р., штат Східна Вірджинія (США); Мекінтош - виведений Дж. Мек-Інтошем із сіянця від вільного запилення сорту Феймез (Канада); Спартан - виведений схрещуванням сортів Мекінтош і Жовтий Н'ютаун (Канада), Флоріна - виведений шляхом багаторазових схрещувань з використанням сіянця №821 виду Malus floribunda і сортів Ром Б'юті, Голден Делішес, Старкинг, Джонатан; Аскольда - отриманий шляхом схрещування з найбільш слаборослим гібридом 25/2-Д з гібридної сім'ї Джонатан х Апорт Олександр і новозеландського сорту Кідс Оранж Ред (Інститут садівництва УААН, автори Копань В.П., Копань К.М.); Катерина - отриманий від запилення в 1978 р. Голден Делішес пилком Мекінтош Важек (ІС, автори Копань В.П., Копань К.М.); Фальстаф - селекції д-ра Ольстона (Міжнародний інститут садівництва, Іст-Моллінг, Велика Британія); Радогость - отриманий від запилення в 1971 р. сорту Джонатан пилком сорту Грінслівз (ІС, автори Копань В.П., Копань К.М.); Теремок - отриманий від схрещування в 1971 р. слаборослого гібриду 25/2-Д (Апорт Олександр х Джонатан) і сорту Грів Руж (ІС, Автори Копань В.П., Копань К.М.). Ці сорти мають ряд цінних ознак, зокрема: лежкість плодів характерна для сортів Айдаред, Аскольда, Спартан, Катерина, Радогость; високі смакові якості плодів притаманні сортам Голден Делішес, Мекінтош, Спартан, Уелспур, Флоріна, Аскольда, Радогость, Катерина; скороплідність і висока продуктивність характерна для сортів як вітчизняної так і зарубіжної селекції і майже всі вищенаведені сорти відрізняються за цими ознаками; зимостійкість - сорти Аскольда, Катерина, Спартан, Радогость, Мекінтош, Теремок; толерантність до борошнистої роси та парші - Катерина, Радогость, Теремок, (до парші), Флоріна (до парші) [33,34].<br /> 2.2. Культивування вегетативних органів і тканин яблуні в культурі in vitrо.<br /> 2.2.1.Введення в культуру in vitro. Методичною основою для введення в культуру in vitro в наших дослідженнях були роботи Zimmerman [52]. Вивчали два способи введення в культуру: І-й спосіб з використанням здерев'янылих, та ІІ-й спосіб - з використанням пагонів, які знаходяться в фазі активного росту. Для введення в культуру in vitro згідно з І-м способом відбирали однорічні пагони молодих дерев (5-6 років) без наявних ознак ураження біотичними та абіотичними факторами після закінчення періоду спокою. Живці відмивали розчином прального порошку "Лотос", після чого ополіскували проточною водою протягом 2-х годин. Стерилізацію здійснювали замочуванням живців протягом 15-30 хв в 0,1-0,3% розчині AgNO3, в який прибавляли кілька крапель тритону Х-100 ("Serva") в якості детергенту. Після цього живці відмивали стерильною дистильованою водою (тричі по 5 хв), потім занурювали в етиловий спирт і пропалювали в полум'ї спиртівки протягом 2-3 с. Простерилізовані в такий спосіб живці нарізали на експланти довжиною 2-3 см таким чином, щоб на кожному розміщувалась одна брунька. Окремі експланти переносили в пробірки з середовищем для культивування (1/2 макросолей МС [186], 1,5% сахарози, 100 мг/л мезо-інозітолу, 500 мг/л гідролізату казеїну, 0,5 мг/л БАП, 0,1 мг/л ІМК). ІІ-й спосіб суттєво відрізнявся від попереднього тим, що рослинний матеріал відбирали в гібридному саду через місяць після початку фази активного росту. Меристеми виділяли як із зелених пагонів так і з етиольованих, - щоб запобігти негативному впливу фенольних сполук, базуючись на дослідженні Liu et al. [49] з деякими змінами. Для отримання етиольованих пагонів одягали на однорічний приріст дерев, які росли в гібридному саду, світлонепроникні ізолятори перед початком розкривання бруньок. Через 3-4 тижні після початку активного росту зрізали етиольовані пагони, стерилізували за допомогою розчину діациду протягом 5-7 хв, потім ополіскували тричі стерильною дистильованою водою, відділяли за допомогою мікроскальпелю верхню частину етиольованого пагону і розміщували на середовище наступного складу: 1/2 солей МС [186], 100 мг/л мезо-інозітолу, 2% сахарози, 0,3 мг/л БАП, 0,05 мг/л ІМК, 1,0 мг/л гібереліну, 8 мг/л гліцину, 0,7% бакто агару (Difco) з додаванням вітамінів - 0,5 мг/л нікотинової кислоти, 0,1 мг/л тіаміну-HCl, 0,5 мг/л піридоксину. Вітаміни стерилізували за допомогою фільтрів Mielex-GP з діаметром пор 0,22 мкм і прибавляли після автоклавування; кислотність середовищ коливалась в межах 5,6-5,8; середовища автоклавували протягом 18 хв при температурі 1210С і тиску 1,2 кПа. Культивування здійснювали в умовах культуральної кімнати: інтенсивність освітлення - 1,5-2 клк, світловий фотоперіод - 16 год, температура - 21-230С, вологість повітря- 60-80%.<br /> 2.2.2.Мікроклональне розмноження. І-й спосіб введення. Після розкривання бруньок відбирали стерильні пагони і розміщували на живильне середовище для мікророзмноження наступного складу: неорганічні солі МС [186], 3% сахарози, 100 мг/л мезо-інозітолу, 100 мг/л гідролізату казеїну, 0,7% бакто агару (Difco), 0,5-2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л ІМК, 0,1 мг/л гібереліну, вітаміни (мг/л): тіамін-HCl - 0,1, нікотинова кислота - 2,0, піридоксин - 0,5, біотин - 1,0, фолієва кислота - 0,01, гліцин - 2,0, Са-пантотенат - 0,5, рибофлавін - 0,1, п-амінобензойна кислота - 1,0, L-тирозин - 1,0. Через кожні 4 тижні пагони розділяли і пересаджували на свіже середовище. Культивування здійснювали в конічних колбах об'ємом 100 мл, в якості пробок використовували фольгу. <br /> ІІ-й спосіб. Через 3 тижні після введення експланти пересаджували на свіже середовище наступного складу: неорганічні солі МС [186], 3% сахарози, 100 мг/л мезо-інозітолу, 0,7% бакто агару (Difco), 0,5 -1,5 мг/л БАП</p>