РОЗДІЛ 2
МЕТОДОЛОГІЯ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Схема досліджень
Дослідження виконані в лабораторії фізіології і біохімії Інституту птахівництва УААН. Для рішення поставлених задач у період з 1997 по 2001 р. проведені експерименти на ембріонах і дорослій птиці: курях породи род-айленд, індичках білої широкогрудої породи, гусаках великої сірої породи, качках української сірої породи, японських перепелах.
Основна частина досліджень проводилася в Інституті птахівництва УААН і його дослідному господарстві "Борки". Птиця утримувалась в кліткових батареях пташників і віварії лабораторії. Групи формувалися за принципом аналогів за віком і живою масою, птицю різних груп кільцювали і мітили стійкими органічними барвниками. Годівля птиці здійснювалася сухими повнораціонними комбікормами, збалансованими за всіма основним поживними і біологічно активним речовинам відповідно до існуючих рекомендацій [83].
Добавки вітамінів, мікроелементів, пробіотиків, мікотоксинів у корм вводилися в дозах, зазначених у схемі кожного досліду. Дослідження проводилися відповідно до нижче приведеної схеми (рис. 2.1).
На першому етапі досліджень були вивчені тканинні особливості накопичення та розподілу ряду природних антиоксидантів: вітамінів А, Е, С в ембріогенезі курей в залежності від стадії розвитку ембріонів курей. Була також вивчена динаміка зміни активності ряду антиоксидантних ферментів у тканинах ембріонів і добового молодняку курей, гусаків, індиків, качок, перепелів.
Інкубація яєць проводилася в лабораторних інкубаторах (ІЛУ-Ф-0.3) при витримуванні стандартних умов за температурою та вологістю. Для рішення поставленої задачі було проведено 2 закладки по 250 яєць курей породи род-айленд. Для досліджень у ембріонів відбиралися: печінка, мембрана жовткового міхура, залишковий жовток, мозок, нирки, грудні та ніжні м'язи.
Дослідження активності ферментів та вмісту вітамінів в тканинах ембріонів курей проводилися через день, починаючи з 14-денного віку.
Терміни відбору зразків тканин у ембріонів курей:
> 14-й день інкубації - залишковий жовток, мембрана жовткового мішка
мозок, печінка, м'язи грудні і ніжні;
> 16, 18, 20, 21-й (вивід) день інкубації і добовий молодняк - ті ж зразки + нирки;
Аналогічна схема вивчення динаміки рівнів вітамінів і активності антиоксидантних ферментів в ембріогенезі та добового молодняку була використана і в дослідах на інших видах сільськогосподарської птиці. У кожному досліді була проведена одна закладка по 150 штук яєць від кожного виду птиці. Для дослідження відбиралися такі органи: печінка, мозок, нирки, а також грудні м'язи. Відбір проб проводили в ключові дні розвитку ембріонів в залежності від їхнього виду: замикання алантоїсу, перехід живлення ембріона з білкового типу на жовтковий, а також перенос яєць на вивід. В індиків і качок це відповідало 13, 21 і 25-му дням розвитку; у гусей - 15, 23 і 28-му дню розвитку; у перепелів 11, 17-му дню розвитку.
Терміни відбору зразків тканин у гусенят:
> 15, 23, 28-й день інкубації і добовий молодняк - мозок, печінка, м'язи грудні, нирки.
Терміни відбору зразків тканин у індичат та каченят:
> 13-й день інкубації - мозок, печінка, м'язи грудні;
> 21, 25-й день інкубації і добовий молодняк - ті ж зразки + нирки.
Терміни відбору зразків тканин у перепелів:
> 11, 17-й (вивід) день інкубації і добовий молодняк - мозок, печінка.
За умов вивчення особливостей впливу різних мікотоксинів: Т-2 токсину, зеараленону й аурофузарину на антиоксидантну систему курей-несучок при аліментарному їх надходженні до організму. Для цього в умовах дослідного господарства "Борки" було сформовано 4 групи курей по 30 голів у кожній. Вік птиці на початок досліду - 150 днів. Тривалість досліду склала 6 тижнів.
Контрольна (1-а) група одержувала стандартний комбікорм без внесення добавок мікотоксинів. У раціони дослідних груп курей-несучок були введені мікотоксини: Т-2 токсин (3 ? - гідрокси - 4 ?, 15 - диацетокси - 8 ? - (3 - метил бутрилокси) 12, 13 - епокситрихотецен); аурофузарин - метаболіт нафтохінонової природи гриба Fusarium graminearum [мол. маса 474, C30H18O12, УФ-спектр в етанолі (з=96%) - 243, 268, 378; ІК-спектр (см-1) - 1677(СО-незв'яз.), 1662 (СО-пірон), 1612 (СО-хелат), 1597 (подвійний зв'язок); основні піки в мас-спектрі, m/z, % - 570 (26), 550 (56), 540 (45), 525 (100), 511 (10)], а також зеараленон [мол. маса 318, C18H22O5 Т0пл. = 163 °С, УФ-спектр в метанолі (з=22,9 М/л), ?мах; нм (?): 315 (6240), 274 (13270), 236 (29400)], належить до бета-лактонів резорцинової кислоти, що є метаболітом гриба Fusarium sроrоtrісhіоіdes 2m-15-278 на зерні. Всі фузаріотоксини, що використовувалися в дослідженнях, було виготовлено в лабораторії мікотоксикології Інституту птахівництва УААН. Т-2 токсин і зеараленон вносили до комбікорму методом поступового змішування. Мікотоксини в кристалічному вигляді розчиняли в етиловому спирті для досягнення певної концентрації мікотоксину. Готували кормову добавку шляхом внесення необхідного об'єму спиртового розчину токсину в 1 кг корму. Після випарювання спирту добавку вносили до основної маси корму, ретельно змішували, і такий корм згодовували піддослідним курям. Концентрація Т-2 токсину в кормі дорівнювала 10 мг/кг, зеараленону - 1,6 мг/кг. Аурофузарин вносили до корму у вигляді культури Fusarium graminearum, оскільки кристалічний аурофузарин є розчинним лише в гарячому фенолі або хлороформі, наявність яких у кормах є неприпустимою. Для цього розмелену культуру, із розрахунку 3% від маси корму (вміст аурофузарину в культурі дорівнював 880 мг/кг), ретельно змішували з комбікормом і згодовували птиці. Концентрація аурофузарину в кормі, таким чином, дорівнювала 26,4 мг/кг. Мікотоксини були введені за наступною схемою: кури 2-ї групи одержували Т-2 токсин; кури 3-ї групи - аурофузарин, кури 4-ї групи - зеараленон. Для проведення біохімічних досліджень на початку даного досліду і всіх наступних було забито 5 голі