РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та реактиви, які були використані в роботі
При виконанні роботи були використані наступні реагенти:
- вірус тютюнової мозаїки, Х-вірус картоплі;
- рослини Nicotiana tabacum cv. Samsun, Nicotiana tabacum cv. trapeson, Lycopersicon esculentum cv. Miliana, Solanum tuberosum сорт Повінь;
- карборунд;
- коркобур;
- водорозчинні солі цинку, міді та свинцю (CuSO4x5H2O, ZnSO4, Pb(NO3)2) вітчизняного виробництва марки "хч";
- ацетон; диметилсульфоксид вітчизняного виробництва марки "хч";
- трихлороцтова кислота; акридиновий оранжевий вітчизняного виробництва марки "хч";
- поліетиленгліколь 6000; уранілацетат; полівінілформальдегід; Кумассі блакитний R-250; N-n-нітрофенілфосфат ("Serva", США);
- додецилсульфат натрію ("Merck", Німеччина);
- набір маркерних білків для електрофорезу білків ("Sigma", США);
- гліцин, акриламід, біс-акриламід ("BDH", Англія);
- неорганічні компоненти буферних систем вітчизняного виробництва марок "хч" та "чда";
- 96-лункові планшети ("Labsystems", Фінляндія);
- бичачий сироватковий альбумін (BSA) ("BDH", Англія);
- кролячі антиген-специфічні імуноглобуліни до ВТМ та ХВК (Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна; Інститут дослідження стійкості рослин, Німеччина, відповідно);
- 1-см кювети кварцові для спектрофотометрії;
- антикролячі імуноглобуліни, кон'юговані з лужною фосфатазою ("Sigma", США).
2.2. Вирощування дослідних рослин
Проростки рослин Nicotiana tabacum cv. Samsun, Nicotiana tabacum cv. trapeson, та Lycopersicon esculentum cv. Miliana вирощували у теплицях у стерильному грунті. Вирощування проводили при постійних контрольованих умовах: відносна вологість - 40-50%, температура - 24-28?С, тривалість фотоперіоду - 16 годин [56, 90]. Надалі рослини Lycopersicon esculentum cv. Miliana віком 21 день переносили у відкритий грунт відповідно до умов експерименту.
Рослини Solanum tuberosum сорт Повінь вирощували в умовах відкритого грунту на мікроділянці.
2.3. Інокуляція дослідних рослин вірусами
Рослини у віці чотирьох справжніх листків інокулювали механічно з допомогою абразиву (карборунд). Концентрація вірусного препарату становила 150-200 мкг/мл у 0.1 М PBS, рН 7.4, у трьохразовому повторенні [90].
2.4. Внесення сполук важких металів у грунт
Важкі метали - мідь, цинк та свинець - вносили у грунт окремо у формі водорозчинних солей (CuSO4x5H2O, ZnSO4, Pb(NO3)2) [37]. Для експериментів з важкими металами використовувалися солі марки "хч". Метали у грунт вносили у концентраціях, що відповідали 1-50 гранично допустимим концентраціям (ГДК), в залежності від експерименту. Фізіологічно обумовлені значення 1 ГДК становлять для міді - 100 мг/кг грунту, для цинку - 300 мг/кг і для свинцю - 100 мг/кг [14, 96] і не відповідають встановленим гігієнічним стандартам України.
При обрахунку необхідної кількості солі враховували масу грунту, у якому вирощувалася рослина (у випадку лабораторних експериментів).
При польових дослідженнях розрахунок необхідної кількості солі виконували виходячи з того, що коренева система кожної рослини займає об'єм, який відповідає масі грунту 1.5-2 кг.
2.5. Відбір зразків рослин
Для препаративного виділення та подальшого накопичення вірусів відбирали зразки рослин з візуальними симптомами вірусного ураження.
Для дослідження вмісту сумарного хлорофілу та концентрації вірусу в експериментальних рослинах відбирали зразки листків рослин з допомогою стерильного металевого коркобура діаметром 7 мм у стерильні пакети.
Для аналізу вмісту хлорофілу зразки відбирали з усіх ярусів листків крім нижнього [25]. У випадку дослідження динаміки накопичення вірусу в інфікованих рослинах зразки відбирали лише з листків, які були розташовані вище інокульованих [90].
Зразки з дослідних рослин відбирали кожні сім днів, одночасно для вимірювання як вмісту хлорофілу, так і концентрації вірусу. Всі зразки відбирали у трьох повторностях з трьох точок та зважували, після чого заморожували.
При фотографуванні рослин відбирали листки та рослини аналогічного віку. Для фотографування симптомів вірусної інфекції не використовували листки, які були інокульовані вірусом на початку експерименту.
2.6. Виділення та очищення вірусних препаратів
Накопичення TMV та PVX здійснювали на рослинах Nicotiana tabacum cv. Samsun.
Виділення та очищення відповідного вірусного матеріалу проводили методом диференціального центрифугування [90]. Свіжозаморожені інфіковані рослини гомогенізували у 0.1 М калій-фосфатному буфері (К2НРО4-КН2РО4), рН 7.4, з додаванням 0.01 М Na2SO3. Надалі проводили освітлення вірусного екстракту хлороформом у співвідношенні 1:4 та наступне низькошвидкісне центрифугування протягом 20 хв при 5 тис. об/хв на центрифузі РС-6. Концентрацію препарату проводили з допомогою інкубації надосадової рідини на магнітній мішалці з додаванням 5% поліетиленгліколю 6000 ("Serva", США) та 1.2% NaCl протягом ночі при 4?С. Після інкубації режим центрифугування становив 8 тис. об/хв протягом 20 хв. Потім осад ресуспендували в 0.01 М калій-фосфатному буфері, рН 7.4, з подальшим високошвидкісним центрифугуванням в режимі 30 тис. об/хв протягом 1.5 год на центрифузі "Beckman" з використанням ротору SW-40; відбирали осад, який знову ресуспендували в 0.01 М калій-фосфатному буфері, рН 7.4, та проводили через сахарозну подушку при 30 тис. об/хв протягом 2.5 год, на тому ж роторі. Осад ресуспендували в 0.01 М тріс-НСІ, рН 7.6, та діалізували протягом ночі при 4?С проти 0.01 М тріс-НСІ. При роботі з вірусним матеріалом були використані буфери, що не містять солей натрію для зручності в подальшій роботі з вірусним матеріалом [22].
Для подальшого визначення вмісту вірусу у відібраних зразках експериментальних рослин з допомогою імуноферментного аналізу зразки гомогенізували у 0.1М карбонат-бікарбонатному буфері, рН 9.6, у розведенні 1:20. Надалі зразки цент