РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали, які використовувались в роботі
Компоненти молекулярного комплексу (МК): високомолекулярним компонентом МК був
комерційний препарат дріжджової РНК (рибисомальна фракція РНК дріжджів
Saccharomyces cerevisiae) (НПО “Біохімреактив”, Олайна, Латвія). Цей препарат
додатково очищували потрійною фенольною депротеїнізацією з подальшим осадженням
етанолом згідно зі стандартною методикою [[ccxxxvii]]. Як низькомолекулярний
компонент МК використовували синтетичний препарат –
2,7-біс[2-(диетиламіно-етокси)-флуорен]-9-он дигідрохлорид (тилорон) (“Sigma”,
США).
Приготування МК. МК у співвідношенні 1/10 (тилорон/РНК, М/М) готували за
допомогою прямого змішування розчинів дріжджової РНК з розчином тилорону у
нижче вказаному фосфатно-сольовому буфері [[ccxxxviii]].
Препарати порівняння:
– стандартний протигерпетичний препарат – віролекс (ациклічний нуклеозид у
вигляді натрієвої солі ацикловіра, “KRKA”, Словенія),
– еталонний індуктор a/b-інтерферону – poly(І)-poly(C) (“Sigma”).
Реактиви, що були були використані у роботі: Na-ЕДТА (версен) (“Serva”,
Німеччина), ридостин (дволанцюгова РНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae, НПО
„Вектор”, Росія), фітогемаглютинін (ФГА) (“Sigma”), ліпополісахарид (ЛПС)
Escherichia coli 026:В6 L-2654 (“Sigma”), актиноміцин Д (ActD) (“Serva”),
L-глютамін (“Sigma”), 4-(2-гідроксіетил)-1-піперазиноетан-сульфонової кислоти
(HEPES) (”Serva”), нітросиній тетеразолій (НСТ) („ДиаэМ”, Німеччина), канаміцин
(“Київмедпрепарат”, Україна), цефазолін (“Київмедпрепарат”), трипановий синій
(“Fluka”, Швейцарія), барвник Романовського – Гімзе (“Fluka”), кристал-віолет
(“Fluka”), сафранін (“Fluka”), азур-еозин (“Fluka”).
Прості хімічні сполуки, які були використані в роботі (табл. 2.1), за винятком
ряду відмічених випадків, застосовували без додаткового очищення.
Таблиця 2.1
Прості хімічні сполуки, що були використані в роботі
Найменування
сполуки
Кваліфікація
чистоти
Додаткова
очистка
HCl
NaOH
NaCl
Na2HPO4
NaH2PO4
КOH
КCl
КH2PO4
CaCl2
MgCl2ґ6H2O
FeCl3Ч6H2O
Етанол, 96%
ч.д.а.
х.ч.
о.с.ч.
ч.
ч.
х.ч.
о.с.ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
ч.
–
перекристалізація
Фосфатно-сольовий буфер (ФСБ) (Дюльбеко) готували шляхом розчинення відповідних
наважок різних солей у бідистильованій воді з наступним фільтруванням. Склад
ФСБ, г: NaCl – 8,0, КCl – 0,20, Na2HPO4 – 1,15, КH2PO4 – 0,20, CaCl2 – 0,10,
MgCl2ґ6H2O – 0,10, води бідистильованої до 1,0 л (рН=7,2) [[ccxxxix]].
0,02 % розчин версену готували шляхом розчинення відповідних наважок різних
солей у бідистильованій воді. Склад даного розчину, г: NaCl – 12,0, КCl– 0,30,
Na2HPO4 – 3,93, КH2PO4 – 0,03, Na-ЕДТА – 0,30, води бідистильованої до 1,5 л.
Розчин стерилізували автоклавуванням при p = 0,15 МПа, t = 121°С протягом 20 хв
[239].
Фізіологічний розчин (“Київмедпрепарат”) використовували для введення тваринам
контрольних груп. Перед використанням на біологічних об’єктах розчини
препаратів стерилізували шляхом фільтрування через мембранні фільтри з
діаметром пор 0,22 мкм (“Синпор”, Чехія).
2.2. Віруси та бактерії
Вірус простого герпесу І типу, штам Л2, отриманий з музею ВНДХФІ ім.
С.Орджонікідзе (Москва), використовували для створення експериментального
герпетичного менінгоенцефаліту in vivo, інфекційний титр вірусу в культурі
клітин Vero складав 7,0 lg ЦПД50/0,1 мл; при інтрацеребральному інфікуванні
мишей – 6,0 lg ЛД50 /0,025 мл.
Вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана, отриманий з музею НДІ
епідеміології і мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї (Москва), використовували для
титрування ІФН, інфекційний титр вірусу становив 8,0 lg ЦПД50/мл.
Бактерії Staphylococcus aureus штам 8325, отримані з інституту епідеміології та
інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевського, використовували для визначення
фагоцитарної та кисень-залежної бактерицидної активності макрофагів.
2.3. Культури клітин і поживні середовища
Культури клітин перещеплюваної лінії нирки зеленої мавпи – Vero та фібробластів
миші – L929, отримані з інституту отоларингології ім. О.С. Коломійченко МОЗ
України.
Культуру клітин Vero використовували для визначення токсичності досліджуваних
препаратів та їх протигерпетичної дії in vitro. Для титрування ІФН та
визначення ФНП в досліджуваних зразках використовували культуру клітин L929.
Для культивування клітин використовували синтетичні поживні середовища
RPMI-1640 (“Serva”), Ігла (НДІ поліомієліту та вірусних енцефалітів, АМН,
Москва), 199 (НДІ вірусних інфекцій МОЗ, Свердловськ, Росія) з додаванням в них
10% ембріональної сироватки телят (ЕСТ) (“Serva”), 25 мМ HEPES, 10 мМ глютаміну
та антибіотиків – канаміцину та цефазоліну (по 100 од/мл кожного). Вивчення
токсичності препаратів, їх противірусної дії та цитодеструктивної дії вірусу
проводили за умови перебування клітин в підтримуючому середовищі (без сироватки
та антибіотиків).
Для промивання клітин використовували розчин Хенкса (НПО “Вирион”, Томськ,
Росія). Для зняття з поверхні скла клітин, що утворюють моношар під час
культивування, використовували розчин версену.
2.4. Тварини
Для вивчення протигерпетичної дії досліджуваних препаратів in vivo
використовували білих безпородних мишей та мишей лінії BALB/c вагою 10–12 г з
віварію Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Кількість, взятих для експериментів тварин, склала 205 штук. У роботі були
використані тварини, які певний час утримувались на карантині і не мали ознак
захворювань. Утримання і поводження із піддослідними тваринами проводили згідно
з вимогами “Європейської конвенції з захисту прав хребетних, використовуваних
для експерименталь
- Київ+380960830922