РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
У роботі представлено матеріали досліджень по вивченню рівнів віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів типів 1, 2 і 3 та факторів, що на них впливають.
У ході виконання роботи застосовано вірусологічний, серологічний, епідеміологічний, мікробіологічний та статистичний методи дослідження.
2.1. Об'єкти вивчення
Віруси. При дослідженнях використано вакцинні поліовіруси типів 1 (LSc 2ab), 2 (P712 CH 2ab), 3 (Leon 12a1b) - еталонні штами, отримані з Референс-центру з діагностики поліомієліту (Росія, Москва).
ЕСНО-30 - штам №1089, виділений із фекалій хворого на серозний менінгіт (16 років), отримано з Київської міської СЕС.
Вірус Коксакі В-5 - штам №26, виділений із фекалій здорової дитини віком 3 роки (Київська область).
Культура клітин. У дослідах використовували перещеплювальну клітинну культуру НЕр-2 (епідермоїдна аденокарцинома гортані людини).
Поживні середовища. Для вирощування перещеплювальної культури клітин використовували поживні середовища 199, Ігла МЕМ виробництва Державного унітарного підприємства по виробництву бактерійних та вірусних препаратів (ДУПВБВП) Інституту поліомієліту і вірусних енцефалітів РАМН. Як стимулятор росту культури клітин використовували ембріональну сироватку великої рогатої худоби виробництва НВП "Сангва", Україна.
Нейрамініни Staphilococcus aureus №392 та Acholeplasma laidlawii, люб'язно надані д.мед.н. С.Л.Рибалко.
Дослідні тварини. Досліди на тваринах проводили у віварії Інституту епідеміології та інфекційних хвороб АМН України. Утримання тварин до і в період проведення експерименту здійснювали з відповідністю до правил Європейської конвенції по захисту тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986). У дослідах використано 71 кролик породи Шиншилла вагою 2,5-3,0 кг. За кролями проводили клінічний нагляд із щоденним спостереженням за станом тварин.
Оральна поліомієлітна вакцина. Вакцина зі штамів Себіна типів 1, 2 і 3 (контрольний номер 149, серійний номер 194 та контрольний номер 222, серійний номер 587), одна доза якої складає 0,2 мл і містить не менше 1000000 інфекційних одиниць поліовірусу типу 1, не менше 100 000 - типу 2 і не менше 300 000 - типу 3 виробництва ДУПВБВП Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН (Росія).
Культури мікроорганізмів. Добові культури Lactobacillus acidophilus (штами №3105 і №3107), Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (штам №2137), Bifidobacterium longum (штам №4201), що входять до складу продукту "Лактовіт білковий", люб'язно надані к.б.н. Н.Ф.Кігель з колекції лабораторії біотехнології Технологічного інституту молока і м'яса Української академії аграрних наук.
Культивування молочнокислих бактерій Lactobacillus acidophilus проводили в MRS-бульйоні з додаванням 0,5% глюкози та 1,0% лактози, рН 5,5-6,0, кількість інокуляту 1,0%. Бактерії виду Streptococcus salivarius ssp. termophilus вирощували в гідролізованому бульйоні, рН 6,8-7,0, кількість інокуляту - 1,0%. Накопичення Bifidobacterium longum здійснювали в середовищі Блаурока, pH 6,8-7,0, кількість інокуляту - 5,0%. Культивування зазначених штамів мікроорганізмів проводили при 370С протягом 24 годин згідно з "Інструкцією по селекції молочнокислих бактерій" [226].
Контингенти дітей різних вікових груп. Загалом у роботі обстежено 240 дітей. З метою вивчення впливу носійства неполіомієлітних ентеровірусів на рівні поствакцинальних віруснейтралізуючих антитіл обстежено здорових дітей дитячих садків "Хоровод" та "Алёнушка" (м. Новоукраїнка Київської обл.) вікової групи, що підлягали 3-й ревакцинації (6 років). До ревакцинації обстежено - 59 дітей, через 1міс. після щеплення - 52 дитини.
На наявність ентеровірусів було обстежено 150 дітей віком 6 та 14 років перед проведенням 3-ї та 4-ї ревакцинації ОПВ та 143 дитини через - 2-4 тижні після ревакцинації.
Бактеріологічно було обстежено 90 клінічно здорових дітей віком 6 років перед проведенням 3-ї ревакцинації ОПВ.
2.2. Методи досліджень
Вірусологічний метод.
Виділення ентеровірусів. Віруси виділяли з проб фекалій дітей, що були відібрані в день проведення чергової ревакцинації та однократно протягом 2-4 тижнів після неї. Виділення вірусів проводили у перещеплювальній клітинній культурі НЕр-2.
З відібраних проб готували 10% суспензії на розчині Хенкса з додаванням хлороформу. Суміш струшували в шутель-апараті протягом 30 хв. при кімнатній температурі. Звільнення суспензії від детриту проводили шляхом центрифугування при 3000 об/хв протягом 30 хв. Надосадову рідину відбирали і зберігали в замороженому стані. Досліджуваним матеріалом інокулювали добовий моношар культури клітин, попередньо відмитої від поживного середовища розчином Хенкса, використовуючи для кожної проби по 4 пробірки. Пробірки витримували протягом 1 год. в термостаті при 370 С, після чого в них вносили підтримуюче поживне середовище. Пробірки інкубували у термостаті при температурі 370С. Облік результатів проводили на 3-7-у добу. Пробірки, в яких визначалася цитопатогенна дія (ЦПД) вірусу, двократно заморожували та відтаювали і робили 2 послідовних пасажі. При відсутності ознак ЦПД у 2-х послідовних пасажах проби знешкоджували.
Ідентифікацію виділених вірусів проводили у реакції віруснейтралізації з діагностичними сироватками для реакції нейтралізації виробництва ДУПВБВП Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН (Росія).
Визначення біологічної активності вірусу in vitro. Титр вірусу визначали макрометодом на пробірках та мікрометодом на полістеролових планшетах з плоскодонними лунками фірми Costar (США). Планшети інкубували у СО2-інкубаторі при температурі 370С в атмосфері з 5% СО2 протягом 3-5 діб [227, 228].
За титр вірусу приймали його найбільше розведення, що викликало дегенерацію моношару культури клітин у 50% пробірок (лунок), тобто тканинну цитопатогенну до