РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Морфофункціональний стан кровоносних судин, ланок гемомікроцирку- ляторного русла і литкового м'яза в нормі, на висоті гіпотермії та в різні терміни після її дії ми досліджували у 220-ти білих безпородних статевозрілих щурів-самців, масою 180-200 г. У кожному експерименті враховується можли-вість екстраполяції на людину результатів досліджень, виконаних на лаборатор-них тваринах. Тому, проводячи вибір піддослідних тварин, ми керувались дани-ми про те, що при порівняльному дослідженні скелетної тканини людини і щурів прослідковувалась їх гомологічність [176, 237, 271]; білі щурі є більш вигідним об'єктом для групового експерименту; окрім того, відомо, що вда-ється знизити температуру їх тіла до 0°С з наступним відновленням нормаль-них функцій і життєздатності [139].
Утримання, догляд за тваринами і всі маніпуляції проводили у відпо-відності з положенням "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 1985 р.).
Матеріалом для дослідження був литковий м'яз щурів.
Піддослідних тварин розділили на чотири групи. Перша група (30 тварин) служила контролем. Друга група (10 тварин) - контроль експерименту, підбір оптимального зниження ректальної температури для зменшення летальності серед тварин. Третю групу складали 30 тварин, яких охолоджували, знижуючи ректальну температуру до + 15оС і відразу забирали матеріал на дослідження. У четвертій групі (150 тварин) вивчали морфофункціональний стан литкового м'яза на 1-шу, 3-тю, 7-му, 14-ту та 30-ту доби після дії загальної глибокої гіпотермії (табл. 2.1).
Тварин контрольної і дослідних груп до і після експерименту утримували
в нормальних умовах віварію на повноцінному харчуванні, без обмежень у питній воді. Щоб виключити вплив добового і сезонного ритмів біологічної активності, експеримент проводили у весняно-літній період, у ранковий час, перед годуванням.
Таблиця 2.1
Загальний розподіл тварин по групах і етапах проведення експериментів
Гру- пи
тва-
ринЕтапи експериментуК-ть тваринМетоди дослідженняін'єк-цій-нийгістологічнийелектро-
номік-
роско-
пічнийгістохімічнийсукци-нат-дегід-
роге-
назна актив-ністьвміст гліко-гену1Контроль305555552Контроль експерименту10 - підбір оптимального зниження ректальної температури3Відразу після дії холоду3055555541, 3, 7, 14, 30-та доби постгіпо-термічного пе-ріоду150252525252525 Всього220353535353535
Евтаназія щурів здійснювалася методом передозування ефіру для наркозу.
Вивчення кровоносних судин, ланок ГМЦР, м'язових волокон, сукцинат-дегідрогеназної активності та топографію глікогену здійснювали комплексними морфофункціональними методами. Для вирішення поставлених завдань були проведені наступні дослідження:
2.1. Експериментальний підбір оптимального зниження ректальної тем-ператури для зменшення летальності серед тварин.
2.2. Охолодження тварин до досягнення стану загальної глибокої гіпо-термії.
2.3. Ін'єкційний метод дослідження кровоносного русла литкового м'яза щурів у нормі та на етапах постгіпотермічного періоду.
2.4. Гістологічні дослідження стінки кровоносних судин, ГМЦР, литкового м'яза в нормі та в різні терміни після дії загальної глибокої гіпотермії.
2.5. Електронномікроскопічне дослідження ГМЦР, м'язових волокон у нормі і після дії загальної глибокої гіпотермії.
2.6. Гістохімічне дослідження сукцинатдегідрогеназної активності м'язо-вих волокон литкового м'яза в нормі та при дії холодового фактора.
2.7. Розподіл вмісту глікогену в м'язових волокнах литкового м'яза в нормі і при дії загальної глибокої гіпотермії.
2.8. Кількісний аналіз результатів гістометричних досліджень із статис-тичною обробкою отриманих даних.
2.1. Експериментальний підбір оптимального зниження ректальної температури для зменшення летальності серед тварин
Стан загальної глибокої гіпотермії виникає при зниженні ректальної температури з + 36оС до + 10-+20оС [90]. Для того, щоб перевірити ці дані і знайти оптимальну температуру, при якій летальність тварин мінімальна, було проведено дослідження. Використано 10 тварин в двох серіях дослідження. В першій серії (5 тварин) ректальну температуру тварин знижували до + 10оС, в другій (5 тварин) - до + 15оС. Результати дослідження показали, що надто висока летальність тварин (із 5-ти через добу загинуло 4-ри) спостерігалась при температурі + 10оС. При зниженні ректальної температури до + 15оС із 5-ти тварин летальності на другу добу не спостерігалось. Тому, в даній роботі використовували зниження ректальної температури до + 15оС для виявлення морфофункціональних змін після дії загальної глибокої гіпотермії протягом 1, 3, 7, 14, 30-ти діб.
2.2. Охолодження тварин до досягнення стану загальної глибокої гіпотермії
Тварин поміщали у холодову камеру, де підтримувалась постійна температура - 32°С. Охолодження тривало 3-4 год. При цьому, ректальна температура знижувалась з +38°С до +15°С, що відповідає температурним межам загальної глибокої гіпотермії (+10-+20°С) [52, 139, 141, 174].
2.3. Ін'єкційний метод дослідження кровоносного русла литкового м'яза щурів у нормі та на етапах постгіпотермічного періоду
Для вивчення кровоносних судин литкового м'яза щурів ми викорис-товували ефірно-хлороформну суміш паризької синьої (10 г фарби на 100 мл розчинника, який складався з ефіру і хлороформу у співвідношенні 3:1). Цю суміш ін'єкували в черевну частину аорти. Через 3-4 год після закінчення заповнення кровоносних судин вищезазначеною сумішшю, проводили забір литкового м'яза і фіксували в 10%-му розчині нейтрального формаліну впродовж 14-ти діб.
На заморожуючому мікротомі виготовляли зрізи, товщиною 30-50 мкм, які зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації, просвітлювали в мети-леновому ефірі саліцилової кислоти і заключали в полістирол. В подальшому вивчали під
- Київ+380960830922