Розділ 2
Матеріали і методи дослідження
2.1. Постановка досліду і об'єкт досліджень
Експерименти проведено на 72 статевозрілих морських свинках-самцях з масою тіла
730-780 г. Всі маніпуляції з експериментальними тваринами проводили із
дотриманням правил, передбачених Європейською комісією по нагляду за
проведенням лабораторних та інших дослідів з участю експериментальних тварин
різних видів, а також згідно „Науково-практичних рекомендацій із утримання
лабораторних тварин та роботи з ними” [100]. Комісією з питань біоетики
Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського
(протокол № 15 від 18.01.2008 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні
науково-дослідної роботи не виявлено. Робота виконана в рамках комплексної
наукової програми кафедри гістології, цитології та ембріології Тернопільського
державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського.
Опікову травму відтворювали згідно методики, розробленої на кафедрах біохімії
та гістології Тернопільського державного медичного університету [173]. Опік
наносили під загальним ефірним наркозом водяною парою при температурі 96-97 0С
на епільовану поверхню шкіри спини тварини протягом 60 секунд. Розміри ділянки
враження становили 18-20 % поверхні тіла, які визначали за спеціальною таблицею
[91]. Результати гістологічних досліджень пошкодженого шкірного покриву
засвідчили глибину ураження, що відповідає опіку ІІІА-ІІІБ ступеня.
Піддослідні тварини були розділені на такі групи:
– інтактні морські свинки – 9 голів;
– тварини з опіковою травмою – 36 голів (контрольна група);
тварини з опіковою травмою, яким після ранньої некректомії пошкодженої шкіри
рани покривали ліофілізованими ксенодермотрансплантатами – 27 голів.
Розподіл тварин по групах та строках виведення з експерименту представлено в
таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин по експериментальних групах
Групи спостережень
Кількість тварин
1. Інтактні тварини
2. Тварини з опіковою травмою:
а) виведені з експерименту на 7 добу
12
б) виведені з експерименту на 14 добу
12
в) виведені з експерименту на 21 добу
12
3. Тварини з опіковою травмою, яким після ранньої некректомії пошкодженої
шкіри, рани покривали ліофілізованими ксенодермотранплантатами
а) виведені з експерименту на 7 добу
б) виведені з експерименту на 14 добу
в) виведені з експерименту на 21 добу
Всього:
72
Тварини всіх груп утримувались на загальноприйнятому раціоні віварію
Тернопільського державного медичного університету. При щоденному огляді
контролювали загальний стан, ступінь прояву місцевих змін в ділянці опікової
рани, масу тіла морських свинок.
Об'єктом дослідження при проведенні експериментів були нирки морських свинок.
Для дослідження морфофункціональних змін в нирках, після опікової травми, а
також при застосуванні ліофілізованої ксеношкіри в умовах проведення ранньої
некректомії, тварин декапітували за допомогою гільйотини під загальним ефірним
наркозом на 7, 14 і 21 доби, в строки, що згідно сучасної класифікації [30],
відповідають стадіям опікової хвороби: відповідно – стадії ранньої і пізньої
токсемії та септикотоксемії. Перед забором матеріалу оглядали опікову поверхню,
відзначали особливості опікового струпа і наявність чи відсутність гнійних
ускладнень в ділянці рани. Після декапітації за допомогою гільйотини тварин
розтинали і швидко забирали нирки, щоб провести фіксування матеріалу до початку
розвитку посмертних змін. Одночасно забирали кров для проведення біохімічних
досліджень.
2.2 Методи дослідження та їх обгрунтування
Для виконання поставлених завдань використовували такі методики: масометричні,
макрометричні, гістологічні, електронномікроскопічні, морфометричні,
статистичні, біохімічні.
Після видалення нирки, її зважували, вимірювали розміри і вирізали із середньої
частини органу шматочки для мікроскопічного дослідження. Забраний матеріал
фіксували в 10 % нейтральному розчині формаліну з триразовою зміною фіксатора,
зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації з наступною заливкою в парафін.
Отримані на санному мікротомі зрізи фарбували гематоксиліном-еозином [67, 116].
Ці класичні методи досліджень дають можливість вивчити структуру тканин нирки в
нормі, а також характер і глибину морфологічних змін, послідовність розвитку
деструктивних та регенераторних процесів при тяжкій опіковій травмі та
лікуванні з використанням ліофілізованої ксеношкіри.
Гістологічні препарати вивчали у світлооптичному мікроскопі і документували за
допомогою мікроскопа ЛОМО Биолам И і системи візуального аналізу гістологічних
препаратів.
Із зазначених методів дослідження, електронномікроскопічний дає найбільш
глибоку і детальну характеристику структурних компонентів нирки. Цей метод
дозволяє встановити тонку організацію фільтраційного та реабсорбційного
компонентів нефрона, та характер їх змін при тяжкій опіковій травмі в умовах
застосування ліофілізованої ксеношкіри [165].
Забір матеріалу для електронномікроскопічного вивчення компонентів нирки
проводили згідно загальноприйнятих правил [165]. Для досліджень вибирали
маленькі шматочки із середньої частини кіркової речовини нирки. Матеріал
фіксували у 2,5 % розчині глютаральдегіду з активною реакцією середовища рН
7,3-7,4, приготовленому на фосфатному буфері Міллоніга. Фіксований матеріал
через 50 – 60 хвилин переносили у буферний розчин і промивали протягом 20 – 30
хвилин. Постфіксацію здійснювали 1 % розчином чотириокису осмію на буфері
Міллоніга протягом 60 хвилин, після чого проводили його дегідратацію в спиртах
і ацетоні та заливали в суміш епоксидних смол і аралдиту.
Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомах УМПТ-7, забарвлювали 1 %
водн
- Київ+380960830922