ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В целях изучения зачатков молочных зубов в начальном периоде их формирования и дифференцировки, материалом служили 11 двенадцатинедельных зародышей человека, которые получены в гинекологическом отделении 5-й городской клинической больницы (г. Полтава) после операций искусственного аборта, необходимость в которых продиктована личными соображениями беременных женщин и, в отдельных случаях, социальными показаниями.
Материалом для изучения зачатков молочных зубов в начальной стадии гистогенеза твердых тканей служили 10 плодов человека на 24 недели внутриутробного развития, полученных в Полтавском областном патологоанатомическом бюро, куда они поступили после операции прерывания беременности по социальным показаниям.
После взятия, зародыши и плоды промывали в физиологическом растворе при температуре 370С, а затем помещали в 4% раствор глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН - 7,4). Спустя сутки после пребывания в холодильной камере, препараты тщательно просматривали под бинокулярной лупой в целях определения оптимального способа иссечения верхних и нижних альвеолярных отростков, которые, сразу же, помещали в свежий раствор глютарового альдегида. После фиксации материал, как обычно, отмывали от избытка фиксатора в фосфатном буфере [51].
В процессе данной подготовительной работы было отобрано 2 препарата верхних альвеолярных отростков 12-недельных зародышей человека для дальнейшей проводки и заключения их в целлоидин-парафин в целях дальнейшего изготовления традиционных гистологических срезов [41,44], которые окрашивали гематоксилин-эозином. Остальные препараты альвеолярных отростков 12-недельных зародышей человека предназначались для заключения их в эпоксидную смолу, согласно требованиям, предъявляемым в трансмиссионной электронной микроскопии [30]. Этой процедуре подлежали также все препараты альвеолярных отростков 24-недельных плодов человека. Однако, учитывая наличие в зачатках зуба этого возраста первых отложений дентина и эмали, данные препараты подвергали процедуре декальцинации.
Декальцинирующим раствором служит хелатообразующий агент, состоящий из 250 г трилона Б, 50 мл 40% раствора гидроксида натрия и 1000 мл дистиллированной воды. Для его получения необходимо в начале 250 г трилона Б поместить в огнеупорную стеклянную колбу с добавлением 200 мл дистиллированной воды и поставить на пламя газовой горелки. Затем, добавив 50 мл 40% раствора гидроксида натрия, все тщательно перемешивают. Дальше, в процессе перемешивания добавляют около 800 мл дистиллированной воды и с помощью 40% раствора гидроксида натрия доводят рН до 7,4. Подогревание прекращают после полного растворения трилона Б. После этого проверяют рН. При необходимости его уравнивают добавлением 40% раствора гидроксида натрия.
После отмывания в фосфатном буфере препараты альвеолярных отростков 12-недельных зародышей и 24-недельных плодов человека погружали на 2 часа в 1% раствор осмия по Millonig [90]. Избавив препараты от фиксатора путем промывки в 0,1М фосфатном буфере в течение 1 часа, переходили к процедуре их дегидратации в спиртах возрастающей крепости, а затем в смеси спирт-ацетон и в 3-х свежих порциях ацетона по 15 мин в каждой. В качестве заливочной среды служил эпон-812.
Получение серий полутонких срезов осуществлено согласно рекомендациям Ю.П.Костиленко на ротационном микротоме, который оснащен специально сконструированным приспособлением для фиксации стеклянных ножей [37].
Данное приспособление представляет собой металлическую планку, в центре которой (перпендикулярно к ней) находится прямоугольное гнездо, где укрепляется стеклянный нож. Надежная фиксация его осуществляется при помощи бокового прижимного винта. Для работы приспособление фиксируется вместе со стеклянным ножом под необходимым углом (3-50).
Эпоксидный блок зажимается в блокодержателе, для чего очень удобными являются патроны, которыми комплектуются ультратомы отечественного производства типа УМТП, так как их хвостик удачно подходит к внутреннему диаметру цанговой головки микротома МПС-2. Оценка качества получаемых срезов осуществляется с помощью стереоскопического микроскопа.
Срезы толщиной 1-3 мкм снимают со спинки сухого ножа при помощи тонкого пинцета, а затем помещают на капли воды, нанесенные предварительно на предметные стекла.
Для закрепления последовательности распределения серийных полутонких срезов использован принцип трафаретной их раскладки по 6-8 штук с одного конца предметного стекла. С этой целью на обычном листе бумаги очерчивается контур предметного стекла и квадратом отмечается местоположение покровного стекла, в пределах которого 6 или 8 кружками обозначаются места для срезов. В процессе работы каждое очередное предметное стекло совмещают с контурами трафарета и согласно отметок распределяют на нем капли дистиллированной воды при помощи полиэтиленовой трубки соответствующего диаметра [35].
Для лучшей фиксации срезов к поверхности покровных стекол их выдерживают в течение суток в термостате при температуре 45-500С.
Полутонкие срезы окрашивали 0,1% раствором толуидинового синего [86] и полихромным методом: раствор основного фуксина, азура-2, и метиленового синего [78], в прописи несколько измененной. Так, в качестве первого красящего раствора нами был использован краситель Маллори, разведенный дистиллированной водой 5-10 раз. Продолжительность окраски в данном случае колебалась в пределах 1-3 минут при умеренном нагревании над пламенем спиртовки. Перекрашенные препараты при необходимости дифференцировали в 700 этиловом спирте. Затем, после просушивания срезы докрашивали раствором 0,01% основного фуксина при комнатной температуре 5-15 минут, непосредственно контролируя ход окраски под микроскопом. Достигнув приемлемой интенсивности окраски, стекла со срезами промывали в воде, высушивали и заключали в полистирол.
Фотографирование препаратов проводили на микроскопе МБИ-3 с микрофотонасадкой МФН-12 и на микроскопе Le
- Київ+380960830922