РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Моніторинг та ідентифікація бактеріального опіку плодових
Моніторинг плодових насаджень по бактеріальному опіку проводили в Закарпатській області (Ужгородському, Берегівському, Виноградівському, Іршавському районах) та Чернівецькій області (Придністровська дослідна станція Інституту садівництва УААН, Сторожинецькому, Кіцманському районах) згідно існуючих методик [45, 149].
Обстеження плодових культур проводили як у промислових садах, так і на присадибних ділянках і здійснювали в три строки:
1. в період цвітіння;
2. в період інтенсивного росту дерев;
3. в період осіннього сокоруху.
Від уражених дерев з характерними для опіку плодових симптомами відбирали зразки з різних частин рослини. При цьому секатором зрізали верхню частину пагону з ураженими квітками довжиною біля 10 см, з ураженим листками, чи одночасно квітами і листками на одній гілці - пагін довжиною 15-20 см, при наявності виразок на корі гілок - відрізки довжиною до 20 см із захопленням здорової частини рослини таким чином, щоб добре була помітна межа між здоровою та ураженою тканиною. При ураженні скелетних гілок чи стовбура робили спили гілок або глибокий зріз кори. З одного дерева по можливості відбирали 3-5 зразків з різних частин рослини. При переході від одного дерева до іншого інструменти дезінфікували 1% формаліном протягом 2-х секунд.
Вивчення ступеня ураження бактеріальним опіком різних сортів груші та яблуні проводили в саду Придністровської науково-дослідної станції Інституту садівництва УААН на 10 модельних деревах кожного сорту. Ступінь ураження визначали за шкалою:
0 - відсутність захворювання;
1 -уражено до 10% поверхні листків, плодів, пагонів;
2 - уражено 11-25% поверхні листків, плодів, пагонів;
3 - уражено 26-50% поверхні листків, плодів, пагонів;
4 - уражено вище 50% поверхні листків, плодів, пагонів [150].
Розвиток захворювання для кожного сорту визначали за формулою:
R - розвиток хвороби, %;
a- кількість уражених рослин;
b - відповідний бал;
N - загальне число обстежених рослин ( листків, плодів );
n - найвищий бал ( при обліку по п'ятибальній шкалі ).
Мікробіологічний аналіз зразків паталогічного матеріалу та ідентифікацію збудника опіку плодових проводили у відповідності із загальноприйнятими методами діагностики збудників бактеріозів [ 6, 83, 85]. Як контроль при проведенні бактеріологічного аналізу, використовували колекційний штам E.amylovora 9057 отриманий з колекції живих культур відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології НАНУ.
Культуральні властивості виділених ізолятів вивчали на таких поживних середовищах: поживному агарі з додаванням 5% сахарози, Кінга Б, Кадо і Гаскет (Д3 ), Кросса і Гудмана .
Склад селективних поживних середовищ:
Середовище Кінга Б
Пептон - 20 г; К2НРО4 - 1,5 г; MgSO4 - 1,5 г; гліцерин - 15 мл; агар - 15 г; дистильована вода - 1000 мл, рН 7,2. Типові колонії E. amylovora кремово-білі, круглі, не утворюють зеленого флуоресціюючого пігменту, який характерний для деяких видів роду Pseudomonas, зокрема для P. syringae var syringae.
Поживний агар з додаванням 5% сахарози
До сухого поживного агару для мікробіологічних досліджень додають 5% сахарози. Доводять рН до 7,2. Стерилізували в автоклаві при температурі 1200С 15 хвилин. На цьому середовищі E. amylovora через 48 годин утворює колонії розміром 3-5 мм і через 72 години - 5-7 мм. Колонії круглі, з радіальними смугами, кремові або білі, блискучі, куполоподібні, слизисті.
Середовище Кадо і Гаскет (Д3)
Сахароза - 10 г, арабіноза - 10 г, гідролізат казеїну - 8 г, дріжджовий екстракт - 2 мл, гліцерин - 3 мл, натрій лимоннокислий - 5 г, калій фосфорнокислий (К2НРО4) - 0,3 г, фуксин кислий - 10 мг, бромтімолблау - 60 мг, агар - 20 г, вода дистильована - 1000 мл, рН 8 . Через 48 годин колонії E. amylovora набувають оранжевого забарвлення, колонії інших видів голубого або зеленого кольору.
Середовище Кросса і Гудмана
Сахароза - 160 г, генціанвіолет - 0,8 мл 0,1% спиртового розчину, циклогексамід - 20 мл, агар - 15 г, дистильована вода - 380 мл. Бактерії Erwinia amylovora утворюють колонії з кратероподібним заглибленням по середині, що добре спостерігається при збільшенні 15х або 30х.
Патогенні властивості виділених ізолятів вивчали на незрілих плодах груші.
Тест на незрілих плодах груші
Використовували незрілі плоди груші чутливих сортів до E. amylovora, які відбирали через 20-30 діб після опадання пелюстків і зберігали в холодильнику при температурі 40C. Цілі або кусочки плодів попередньо вимиті і протерті 5% розчином перекису водню заражали уколом через шкірку суспензією бактерій
108 кл/мл в стерильній воді або екстрактом із ураженого матеріалу. Заражені плоди ставили в чашки Петрі, дно яких застеляли шаром вати і фільтрувальним папером. Чашки витримували в термостаті при температурі 25 0С. За контроль були взяті плоди груші інокульовані стерильною водою (від'ємний ) і колекційним штамом E. amylovora 9057 (позитивний). Облік проводили через 24, 48 і 72 години. Позитивна реакція - утворення білого ексудату на поверхні плода.
Для визначення патогенних властивостей у виділених ізолятів ставили реакцію надчутливості на листках тютюну.
Тест на листках тютюну
Суспензію бактерій 108 кл/мл в стерильній воді вводили інсуліновим шприцом в жилку з нижнього боку листка тютюну. Через 24-48 годин місце інфільтрації стає хлоротичним і некротизується.
Для визначення видової належності виділених патогенних ізолятів проводили вивчення морфологічних, фізіологічних, біохімічних та серологічних властивостей згідно існуючих методик [6, 78, 80, 83, 85, 89, 151].
При вивченні морфології клітин особливу увагу приділяли характеру розміщення джгутиків. Фарбування джгутиків здійснювали за методом Шеффера [85].
Наявність оксидазної активності